單純皰疹病毒（HSV-2）包膜糖蛋白gG-2的克隆表達(dá)產(chǎn)物的純化及其診斷試劑盒的制備.pdf

1、單純皰疹病毒(HSV)可分為HSV-1和HSV-2兩種血型。HSV-2型可引起生殖器皰疹、新生兒皰疹等，其中新生兒皰疹的病死率高達(dá)60％，孕婦感染后是造成嬰兒先天畸形的主要病原體，同時(shí)對(duì)孕婦也可引起嚴(yán)重病變，如壞死性肝炎等，病死率達(dá)50％，也是器官移植及AIDS病人并發(fā)感染死亡的常見原因之一。并認(rèn)為與宮頸癌的發(fā)生有關(guān)。因此感染HSV的早期診斷及分型具有重要意義。 目前國內(nèi)外單皰疹病毒分型方法大概有PCR直接分型、單克隆抗體法、免

2、疫學(xué)檢測(cè)。由于PCR檢測(cè)操作過程的高要求和易出現(xiàn)假陽性；單克隆抗體分型法有較大的實(shí)用性，但有時(shí)表現(xiàn)為不完全特異性；核酸探針技術(shù)操作煩瑣，造價(jià)高，應(yīng)用受限；免疫血清學(xué)中的ELISA法，簡(jiǎn)便快速、靈敏度高、價(jià)格低廉、。國內(nèi)用于檢測(cè)用抗原大多還依賴進(jìn)口，尋求一種特異性高，純度高，價(jià)格低廉的抗原具有現(xiàn)實(shí)意義。 隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，基因工程抗原逐漸代替?zhèn)鹘y(tǒng)的抗原廣泛的應(yīng)用于各種檢測(cè)，基因工程抗原結(jié)構(gòu)單純，性質(zhì)穩(wěn)定，特異性高。

3、目的:該項(xiàng)研究的主要目的是用基因工程方法表達(dá)HSV-Ⅱ血清型特異性抗原，代替?zhèn)鹘y(tǒng)的病毒檢測(cè)抗原制備試劑盒，以提高檢測(cè)的特異性，敏感性，降低檢測(cè)成本，促進(jìn)病毒檢測(cè)的發(fā)展。 方法:根據(jù)genebank所查的HSV-2gG-2基因和相關(guān)文獻(xiàn)選取特異片斷，設(shè)計(jì)引物，用PCR方法調(diào)取基因，將PCR產(chǎn)物切膠回收后與pET-30a載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α，篩選。對(duì)陽性菌落測(cè)序后，將帶有目的基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21菌株，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-

4、PAGE檢測(cè)蛋白的表達(dá)，用westen方法鑒定蛋白抗原性，用交叉連續(xù)稀釋分析法滴定抗原滴度，然后包被酶標(biāo)板制作試劑盒，與傳統(tǒng)HSV-Ⅱ、HSV-Ⅰ抗原制作的試劑盒、PCR試劑盒比較其陽性符合率，陰性符合率，其敏感性，特異性為。將試劑盒放置不同溫度條件(4℃、37℃、室溫)不同時(shí)間(6月、10d、3月)后，與新鮮制作的試劑盒比較研究了試劑盒的穩(wěn)定性。并初步應(yīng)用于臨床性病患者的標(biāo)本檢測(cè)。 結(jié)果:1、工程菌表達(dá)的目的蛋白具有預(yù)期抗原活

5、性;2、用純化基因工程抗原包被酶標(biāo)板制備了IgM檢測(cè)試劑盒;3、用基因工程抗原制作的試劑盒與傳統(tǒng)試劑盒比較，其陽性符合率為70％，陰性符合率為96.7％。表明基因工程抗原制作的試劑盒特異性高，敏感性強(qiáng)。與PCR試劑盒比陽性符合率為83.3％，陰性符合率為86.7％，有較高的符合率，且假陽性率低。表明基因工程抗原試劑盒的可行性。穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果，表明所建立的試劑盒穩(wěn)定可靠，易于4℃長(zhǎng)期存放、相對(duì)較高溫度的短期存放(如運(yùn)輸?shù)?，利于推廣使用;