Bt蛋白試劑盒的制備及抗蟲棉Bt蛋白時空表達(dá)的研究.pdf

1、轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉在我國應(yīng)用最廣，它對鱗翅目害蟲具有較強(qiáng)的抗性。利用基因工程技術(shù)轉(zhuǎn)入棉花中的Bt基因可以在棉花各組織器官中高效表達(dá)，合成對鱗翅目害蟲具有高效毒殺作用的Bt蛋白。但若在生產(chǎn)上仍用常規(guī)栽培管理法，品種的產(chǎn)量潛力就不能正常發(fā)揮，甚至在不同的生態(tài)棉區(qū)造成產(chǎn)量顯著降低。本文以市售Bt殺蟲粉劑為原料，純化、結(jié)晶出高純度的Bt晶體蛋白，依此得到Bt蛋白抗體，制備出Bt蛋白試劑盒，并對轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉與常規(guī)非抗蟲棉進(jìn)行了棉花在不同時空的抗

2、蟲性研究，旨在為抗蟲棉的檢測提供快速、有效的檢測方法，并為抗蟲棉的田間管理提供理論基礎(chǔ)。其研究結(jié)果如下： 1.以市售的Bt蛋白粉劑為原料，采用堿解、層析和乙醇沉淀的生物化學(xué)的方法提取純化Bt晶體蛋白。結(jié)果表明，在pH10.5時，堿解程度最高，采用60％飽和度的硫酸銨沉淀可以去除大多數(shù)的多糖，G-50層析柱將Bt蛋白(130KD)與其他蛋白分開，上清用1.2-1.5倍的95％乙醇沉淀，即可得到晶體狀Bt蛋白，凍干稱重，得率為1.3

3、38g/KgBt蛋白粉劑。考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白純度為91％，SDS-PAGE測定晶體蛋白的分子量為130KD。 2.采用實(shí)驗室飼養(yǎng)棉鈴蟲的方法，棉鈴蟲的初孵蟲、一鈴蟲、二鈴蟲48小時的死亡率為100％，三鈴蟲48小時的死亡率為88％，四鈴蟲48小時的死亡率為76％，生物活性達(dá)18000IU/mg。 3.實(shí)驗用2Kg重的新西蘭大白兔，采用免疫學(xué)制備抗體的方法，由兔血清以飽和硫酸銨沉淀提取蛋白，再以A-50層析后，加冷的95

4、％乙醇沉淀制備抗體，所得抗體的滴度為32(瓊脂凝膠擴(kuò)散法)，完全可作為試劑盒使用(要求滴度不低于16)。 4.所制備的Bt蛋白試劑盒與進(jìn)口的Agdia試劑盒做實(shí)驗對比，結(jié)果表明：自制試劑盒Bt蛋白濃度線性范圍為1750～28000ng·ml-1，而Agdia試劑盒Bt蛋白濃度線性范圍為2250～36000ng·ml-1，可見自制試劑盒檢測靈敏度比Agdia試劑盒的檢測靈敏度稍高，但檢測范圍比Agdia試劑盒稍窄。自制試劑盒的精確

5、度稍差，穩(wěn)定性不是很好，有待進(jìn)一步實(shí)驗探索。 5.對轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉與非抗蟲棉在不同時間和不同的器官進(jìn)行取樣，用自制的Bt蛋白試劑盒檢測(棉花葉取主干莖葉)，結(jié)果顯示，同一時期，同一棉株上，倒1葉Bt毒蛋白含量較低，倒2葉較高，倒3葉最高，而倒5葉較倒3、4葉又有所下降，表明Bt基因在葉片中的表達(dá)產(chǎn)物隨葉齡的變化而變化。在不同的生長時期，隨著幼苗的生長，Bt蛋白的表達(dá)量也隨之增加，均可達(dá)到抗蟲的最低限度，特別是蕾期和結(jié)鈴期，棉花

6、葉中的Bt蛋白含量最高，但到吐絮期以后，Bt蛋白的表達(dá)量逐漸降低，棉花葉中的Bt蛋白含量最低，已經(jīng)低于抗蟲所要求的最低限度，不同生長時期棉花葉Bt蛋白表達(dá)趨勢為：初花期＞蕾期＞花鈴期＞苗期＞吐絮期。9種組織對棉鈴蟲初孵幼蟲的抗性順序為：功能葉＞嫩葉＞幼蕾＞幼鈴＞幼葉＞花瓣＞花蕊＞苞葉＞老葉。 6.同一位置不同時期的棉花葉子(倒2葉，完全展開功能葉)，經(jīng)ELISA檢測結(jié)果顯示：抗蟲棉在生長初期，棉花葉子中Bt蛋白的表達(dá)就開始活躍，