牛皰疹病毒5型糖蛋白基因gG功能研究.pdf

1、BHV-1、BHV-5屬于皰疹病毒科、α皰疹病毒亞科、水痘病毒屬。BHV-1目前在世界范圍內(nèi)流行,除南美部分國家之外,世界各國都已分離到該病毒。該病毒引起以鼻氣管炎、高熱、流產(chǎn)、眼結(jié)膜炎、傳染性膿皰為特征的呼吸道疾病,還可引起外陰道炎、普遍的全身感染,每年給養(yǎng)牛業(yè)帶來的損失超過10億美元。BHV-5能夠引起牛致命性腦膜腦炎。BHV-5能進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS),能夠引起小牛嚴(yán)重的致死性的腦膜腦炎,引起成年牛亞臨床癥狀,給養(yǎng)牛業(yè)造成很大

2、的損失。
　　 gG是BHV的主要囊膜糖蛋白之一,它在α皰疹病毒中相對(duì)保守,gG可影響病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)有效增殖與細(xì)胞間擴(kuò)散,在體外與病毒在細(xì)胞間侵染有關(guān),并且可以阻止細(xì)胞的凋亡,但BHV-1 gG和BHV-5 gG的趨化能力是否有差異還不明確,BHV-5 gG胞外區(qū)能夠和趨化因子結(jié)合,但具體的功能域尚不清楚。
　　 本研究構(gòu)建了幾個(gè)突變株,通過動(dòng)物試驗(yàn)探討gG對(duì)BHV-5致病性的影響。利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)分段表達(dá)了BHV

3、-5 gG片段,進(jìn)一步通過做趨化試驗(yàn),探討B(tài)HV-1 gG和BHV-5 gG的趨化能力的差異以及BHV-5 gG具有趨化功能的區(qū)域。主要工作包括:
　　 1.突變株的構(gòu)建
　　 本試驗(yàn)以牛皰疹病毒5型全基因組(基因登錄號(hào)為AY261359)為模板,設(shè)計(jì)引物,PCR擴(kuò)增gG基因上游約1.0kb和下游1.1kb的片段作為同源重組臂,分別克隆到pMD18-T載體上。用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶將下游同源臂片段回收,定向插入到含有上游同

4、源臂片段的載體中,構(gòu)建中間轉(zhuǎn)移載體,命名為pZF09-13。然后在上下游同源臂中間插入帶有完整啟動(dòng)子的EGFP報(bào)告基因,構(gòu)建重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒,命名為pZF09-14。將pZF09-14線性化,回收含有上下游同源臂的序列,并將其與質(zhì)粒pBICP0和BHV-5基因組DNA用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法在MDBK上共轉(zhuǎn)染,成功地進(jìn)行了同源重組,經(jīng)過4輪篩選和純化獲得了BHv-5△gG/EGFP突變株。用同樣的方法成功構(gòu)建BHV-5△gG/EGFP回復(fù)突變株和BH

5、V-1△gG/EGFP回復(fù)突變株。
　　 2.BHV-5 gG表達(dá)系統(tǒng)的建立
　　 將BHV-5 gG的蛋白序列用軟件分析,分為三段,分別設(shè)計(jì)引物,以pZF09-40為模板擴(kuò)增各片段,將各片段分別克隆到pMD18-T載體上,經(jīng)測(cè)序鑒定后,原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá),并用western驗(yàn)證。再用限制性內(nèi)切酶酶切回收,克隆到pFastBacTM1載體,提取重組的bacmid,轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞,用PCR驗(yàn)證重組桿狀病毒gG基因的插入,再感

6、染High—five細(xì)胞,經(jīng)western驗(yàn)證,gG片段得到表達(dá)。gG1大小為27KD,gG2未表達(dá),gG3大小為55KD。
　　 3.趨化試驗(yàn)
　　 將BHV-5 wt、BHV-5△gG/EGFP、BHV-5△gG/EGFP rev、BHV-1 wt、BHV-1△gG/EGFP、BHV-1△gG/EGFP rev按1個(gè)MOI接種MDBK細(xì)胞,24h后,收獲上清,作為趨化反應(yīng)樣品,將樣品與趨化因子同時(shí)加到趨化小室中,作用

7、30min,在上面小室中加中性粒細(xì)胞,45min后,計(jì)算趨化小室中的細(xì)胞數(shù),BHV-1和BHV-5組內(nèi)的三株病毒的趨化性無明顯差異。按上述方法檢測(cè)BHV-5 gG蛋白不同區(qū)段與趨化因子結(jié)合的能力,結(jié)果表明gG2結(jié)合能力較強(qiáng)。
　　 4.動(dòng)物試驗(yàn)
　　 試驗(yàn)以新西蘭白兔為動(dòng)物試驗(yàn)?zāi)Ｐ?分兩組,一組用BHV-5 wt接種,另一組用BHV-5△gG/EGFP接種。每天觀察動(dòng)物神經(jīng)癥狀,結(jié)果7dpi時(shí)BHV-5 wt組和BHV-