巴斯德酵母真核表達(dá)IGRP206-214-dtSCT的制備及其活性研究.pdf

1、Ⅰ型糖尿病(Type1 diabetes，T1D)是一種自身免疫性疾病，體內(nèi)的細(xì)胞毒性T淋巴淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)識(shí)別并殺傷胰島β細(xì)胞，誘發(fā)胰島炎，造成體內(nèi)由胰島β細(xì)胞分泌的胰島素水平降低，機(jī)體血糖指數(shù)升高，最終引起糖尿病的發(fā)生。正常機(jī)體生理情況下，體內(nèi)針對(duì)胰島β細(xì)胞的CTL本應(yīng)被陰性選擇后清除或者選擇性沉默，但由于遺傳變異、病毒感染等因素，出現(xiàn)異常增殖，并能在膜表面表達(dá)可與主要組織相容性復(fù)合物

2、一類分子(Major histocompatibility complex，MHC-Ⅰ)提呈的胰島β細(xì)胞相關(guān)的抗原肽相結(jié)合的特異性T細(xì)胞抗原受體T細(xì)胞（抗原）受體T cell receptor，TCR，這些抗原肽包括葡萄糖-6-磷酸酶催化亞基相關(guān)蛋白(Glucose-6-phosphatase catalyzes acyl-relatedproteins，IGRP)、胰島素(Ins)、谷氨酸脫羧酶(Glutamate decarboxy

3、lase，GAD)等。成熟的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞通過(guò)全身血液循環(huán)選擇性遷移趨化募集到胰島中，分泌穿孔素、顆粒酶等多種細(xì)胞因子來(lái)?yè)p傷胰島β細(xì)胞。
　　錨合到MHC-H類分子的抗原結(jié)合槽中的IGRP206-214九肽(VYLKYNVFC)可以通過(guò)與TCR的結(jié)合將抗原信息傳遞給特異性CTL，而可溶性的抗原肽-MHC-Ⅰ類分子也能達(dá)到相同的效果。課題組前期通過(guò)引入單鏈三聚體(single chain trimer，SCT)以及二硫鍵捕獲(dis

4、ulfide trapping，dt)技術(shù)，設(shè)計(jì)了IGRP206-214-H-2Kd-dtSCT的編碼基因并通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)制備了相關(guān)蛋白，驗(yàn)證了蛋白活性。本課題改用真核系統(tǒng)來(lái)表達(dá)IGRP206-214-H-2Kd-dtSCT（Eukaryotic-IGRP206-214dtSCT，eIGRP206-214-dtSCT），研究真核表達(dá)系統(tǒng)是否對(duì)目的蛋白具有糖基化修飾以及初步驗(yàn)證糖基化修飾的蛋白是否具有相同的生物活性。
　　目的:<

5、br>　　將IGRP206-214-H-2Kd-dtS CT的編碼基因利用質(zhì)粒重組到巴斯德酵母的染色體中，從而獲得穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄翻譯;通過(guò)甲醇發(fā)酵誘導(dǎo)獲得目的蛋白;確認(rèn)巴斯德酵母對(duì)目的蛋白進(jìn)行了糖基化修飾;制備IGRP206-214-H-2Kd-dtS CT-四聚體(IGRP-Tetramer)以及四聚體偶聯(lián)毒素(IGRP-SAP)，體外流式檢測(cè)真核蛋白的生物學(xué)活性。
　　方法:
　　(1)取本實(shí)驗(yàn)室保存的DH5α-pet22b

6、-IGRP206-214-H-2Kd-dtSCT菌株，設(shè)計(jì)上下游引物，PCR獲得IGRP206-214-H-2Kd-dtSCT的編碼基因，設(shè)計(jì)基因序列，以引物補(bǔ)足5'端信號(hào)肽α-因子、帶入HRV3C識(shí)別位點(diǎn)、Avi-Tag、6×his-tag以及雙酶切位點(diǎn)，插入到pPICZαA質(zhì)粒中，并通過(guò)中間宿主菌大腸桿菌DH5α得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄。小提質(zhì)粒，并單酶切線性化后電轉(zhuǎn)到巴斯德酵母GS115中，博來(lái)霉素抗性篩選陽(yáng)性克隆，并篩選高表達(dá)菌株。甲醇誘導(dǎo)

7、培養(yǎng)基培養(yǎng)重組GS115，誘導(dǎo)目的蛋白的分泌表達(dá)，48-72h后過(guò)濾、濃縮培養(yǎng)基上清，上蛋白純化系統(tǒng)。純化后的目的蛋白切除C端多余氨基酸片段，生物素化后，再次利用蛋白純化系統(tǒng)去除游離的生物素以及HRV3C protease。純化的目的蛋白制備四聚體，驗(yàn)證蛋白生物素化效率。并偶聯(lián)毒蛋白皂草素。
　　(2)rIGRP206-214-H-2Kd-dtSCT-Tetramer(原核表達(dá)的IGRP206-214單鏈三聚體:Recombina

8、nt-IGRP206-214dtSCT，rIGRP206-214dtSCT)偶聯(lián)PE制備用于特異性流式檢測(cè)IGRP抗原特異性CTL的熒光蛋白(PE-IGRP-dtSCT);Dot-blot、western blot鑒定eIGRP206-214-H-2Kd-dtS CT蛋白的構(gòu)象正確性;PNGase F切除真核系統(tǒng)表達(dá)的目的蛋白上的糖鏈，飛行時(shí)間質(zhì)譜比對(duì)切除前后分子量變化，確認(rèn)糖基化修飾的存在;可溶性eIGRP206-214-Tetram

9、er聯(lián)合IL-2添加到12周齡NOD雌鼠脾臟淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液中共培養(yǎng)72h，流式檢測(cè)IGRP抗原特異性CTL細(xì)胞頻率變化;可溶性eIGRP206-214-Tetramer偶聯(lián)SAP添加到12周齡NOD雌鼠脾臟淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液中共培養(yǎng)7天，流式檢測(cè)IGRP抗原特異性CTL細(xì)胞頻率變化。
　　結(jié)果:
　　(1)構(gòu)建的重組質(zhì)粒pPICZαA-IGRP206-214-H-2Kd-dtSCT成功導(dǎo)入GS115菌株中，使菌株獲得Zeocin

10、抗性，PCR驗(yàn)證與對(duì)照組雙酶切的DH5α中的pPICZαA-IGRP206-214-H-2Kd-dtSCT有相同大小的條帶，并且條帶大小符合前期設(shè)計(jì)要求，基因測(cè)序結(jié)果說(shuō)明構(gòu)建的基因片段符合設(shè)計(jì)要求。甲醇誘導(dǎo)后培養(yǎng)基中與對(duì)照轉(zhuǎn)化空質(zhì)粒組相比51kDa處出現(xiàn)明顯的條帶。純化后目的蛋白純度達(dá)到95％以上。生物素化結(jié)果顯示去除了大部分游離生物素，生物素化效率檢測(cè)，以蛋白:Streptavidin質(zhì)量比不同濃度的情況，目的蛋白依然完全形成多聚體，

11、目的蛋白完全生物素化。
　　(2)成功制備了PE-IGRP-dtSCT，并且排除了熒光蛋白的非特異性;采用H-2Kd構(gòu)象單抗，蛋白印跡結(jié)果顯示真核系統(tǒng)表達(dá)的蛋白具有天然的正確空間構(gòu)象;eIGRP206-214-dtSCT體外實(shí)驗(yàn)表明能夠隨著體系中蛋白濃度的提升，促進(jìn)IGRP抗原肽特異性CTL的細(xì)胞頻率增加，并且有顯著差異;eIGRP206-214-dtSCT偶聯(lián)SAP后能夠顯著降低IGRP抗原肽特異性CTL的細(xì)胞頻率，并且較rIG