載siCTGF殼聚糖納米粒在兔耳增生性瘢痕中的應(yīng)用研究.pdf

1、研究背景：
　　增生性瘢痕往往是皮膚在遭受創(chuàng)傷或重度燒傷后難以避免的愈合結(jié)果。瘢痕繼續(xù)發(fā)展還會導(dǎo)致皮膚瘙癢、活動受限、外觀畸形以及攣縮等諸多問題，給患者生理和心理兩方面均造成不良影響。據(jù)統(tǒng)計，每年有數(shù)百萬人遭受瘢痕帶來的身心傷害，生活質(zhì)量很差。由于傳統(tǒng)治療手段難以產(chǎn)生滿意的效果，因此迫切需要尋找一種新的治療方式來防治增生性瘢痕。
　　1991年Bradham等首先在人臍靜脈內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)人類CTGF。CTGF作為一類基

2、質(zhì)細胞蛋白，主要表達于成纖維細胞、肝星狀細胞、軟骨細胞等間質(zhì)細胞，在機體生長發(fā)育及損傷時表達相應(yīng)增加。CTGF病理生理功能主要是刺激細胞有絲分裂、粘附、凋亡、ECM合成分泌以及促進其他類型細胞的遷移，同時它還能夠改變其他分子的活性。最近，越來越多文獻證實CTGF在病理性瘢痕真皮層中過量表達，但是其參與瘢痕形成的具體機制仍不十分清楚。
　　干擾(interference RNA) RNA是一種短雙鏈RNA，作為一種基因沉默技術(shù)，其可

3、以與mRNA互補配對并促使其降解，最終發(fā)揮特異性基因阻斷作用。siRNA作為RNAi技術(shù)的一種，相比反義核酸技術(shù)，具備基因抑制率高、特異性強以及濃度低等優(yōu)勢，在基因功能研究領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用。然而，由于體內(nèi)外環(huán)境的復(fù)雜性，諸如核酸酶等酶類的存在，本身就不穩(wěn)定的裸siRNA在進入細胞和胞核前極易被降解，因此總體轉(zhuǎn)染效率不高。之后雖然化學修飾或病毒載體等一些改進措施可以延緩其降解，但又帶來細胞毒性大、效果差等缺點。因而，急需尋找一種更理想的

4、轉(zhuǎn)染載體來介導(dǎo)siRNA進入細胞并發(fā)揮基因阻斷效應(yīng)。
　　殼聚糖是一種非病毒載體，具有細胞毒性低、免疫原性低、降解性好和生物相容性良好等優(yōu)點。此外，作為唯一一種天然陽離子材料，殼聚糖還可以與帶負電荷的核酸如DNA、siRNA以及miRNA等結(jié)合形成納米復(fù)合物。殼聚糖納米載體主要通過增進與帶負電細胞膜的粘附和避免siRNA被內(nèi)源性核酸酶降解兩個方面來提高siRNA的基因干擾效率。近年來，殼聚糖納米粒作為一種安全、經(jīng)濟的非病毒載體，已

5、經(jīng)獲得了越來越多的關(guān)注。
　　基于以上背景，本研究通過將載siCTGF殼聚糖納米粒應(yīng)用于新愈合兔耳皮膚創(chuàng)面，通過靶向干擾CTGF的表達及其生物學功能，進而抑制成纖維細胞過度增殖、分化以及減少膠原蛋白合成沉積，最終發(fā)揮減輕瘢痕形成的作用。載siCTGF殼聚糖納米粒有望成為一種安全、有效的瘢痕防治技術(shù)。
　　第一部分構(gòu)建siCTGF以及篩選最佳干擾序列
　　研究目的:分離培養(yǎng)及鑒定原代瘢痕成纖維細胞;確認構(gòu)建序列的有效性并

6、篩選最佳干擾序列。
　　研究方法:采用組織塊貼壁和胰蛋白酶聯(lián)合消化的方法，分離培養(yǎng)瘢痕成纖維細胞，并采用流式細胞術(shù)鑒定瘢痕成纖維細胞。參照siRNA設(shè)計原則，應(yīng)用RNA在線設(shè)計軟件，設(shè)計3段RNA干擾序列，分別轉(zhuǎn)染瘢痕成纖維細胞，并以無同源性的亂碼siRNA作為對照組，應(yīng)用RT-PCR、蛋白印跡等方法檢測各組細胞CTGF mRNA及蛋白的表達，比較分析后選出沉默效率最大的一組siCTGF。
　　研究結(jié)果:該改進的方法能夠快速

7、分離出高活性的成纖維細胞，流式細胞儀得到FSP陽性率可達94.37±1.31％。該合成方法所構(gòu)建的siRNA能成功轉(zhuǎn)染成纖維細胞。與未轉(zhuǎn)染組和亂碼組相比，候選序列3的基因抑制效率最高，CTGFmRNA表達降低到0.294±0.093倍，CTGF蛋白表達降低到0.33±0.065倍，均有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。
　　研究結(jié)論:干擾序列3的成纖維細胞CTGF基因沉默效率最高。
　　第二部分載siCTGF殼聚糖納米粒的制備及相

8、關(guān)特性的研究
　　研究目的:探討載siCTGF殼聚糖納米粒制備方法及其相關(guān)物理特征。
　　研究方法:采用經(jīng)改進的離子膠凝法，通過對分子量、氮磷比等條件進行摸索來制備載siCTGF殼聚糖納米粒。粒徑分析儀和透射電鏡分別檢測納米粒平均粒徑和電位，紫外分光光度計計算載藥率，同時對其在體外的控釋周期以及細胞毒性實驗進行測定，最后完成納米粒在細胞內(nèi)的示蹤。
　　研究結(jié)果:投射電鏡圖像顯示殼聚糖納米粒呈圓形顆粒，大小一致，分布均勻

9、，平均粒徑在98.3±2.7nm左右。粒徑分析儀測得zeta電位為15.3±4.2mV。siCTGF的包封率為96.5±2.4％。在PBS溶液中體外控釋周期最長可達6天。CCK8細胞毒性實驗提示空白對照組與陰性對照組相比，各濃度殼聚糖納米粒組未見明顯細胞毒性，無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　研究結(jié)論:本方法制備的殼聚糖納米粒具備粒徑小、細胞毒性低以及體外控釋周期長等特點，是一種較好的基因轉(zhuǎn)染載體。
　　第三部分體外實驗評

10、價載siCTGF殼聚糖納米粒對瘢痕成纖維細胞的作用
　　研究目的:評價體外應(yīng)用載siCTGF殼聚糖納米粒對成纖維細胞纖維化基因表達的抑制效果。
　　研究方法:實驗按照空白對照組、載亂碼RNA殼聚糖納米粒組、三種濃度載siCTGF殼聚糖納米粒組(50nmol/ml，100nmol/ml，200nmol/ml)分成5個組。選用CCK8試驗方法比較各組對瘢痕成纖維細胞增殖效率的影響;RT-PCR、Western-blot等技術(shù)測定

11、目標基因CTGF、細胞外基質(zhì)成分Ⅰ型膠原以及細胞分化標志α-SMA的表達。
　　研究結(jié)果:CCK8法結(jié)果顯示相比空白組和陰性對照組，各濃度載siCTGF殼聚糖納米粒組細胞增殖得到不同程度抑制，均存在統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。RT-PCR、Western-blot等技術(shù)測定目標基因CTGF、細胞外基質(zhì)成分Ⅰ型膠原以及細胞分化標志α-SMA表達，結(jié)果顯示載siCTGF殼聚糖納米粒組3種基因的表達水平均明顯低于空白組和陰性對照組(P＜

12、0.05)，又以200nmol/ml載siCTGF殼聚糖納米粒組下降程度最高。
　　研究結(jié)論:體外應(yīng)用載siCTGF殼聚糖納米粒能有效抑制成纖維細胞增殖，Ⅰ型膠原蛋白合成以及向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)分化。
　　第四部分局部應(yīng)用載siCTGF殼聚糖納米粒對兔耳瘢痕增生的影響
　　研究目的:評價局部應(yīng)用載siCTGF殼聚糖納米粒對瘢痕增生的抑制效果。
　　研究方法:實驗動物按照空白對照組、載亂碼RNA殼聚糖納米粒組，三種濃度

13、載siCTGF殼聚糖納米粒組分成5組。采用活體成像儀監(jiān)測納米粒在裸鼠體內(nèi)的控釋周期;建立兔耳瘢痕模型，局部注射不同濃度載siCTGF殼聚糖納米粒，肉眼觀察局部創(chuàng)面瘢痕增生的大體圖像，并超聲探測儀動態(tài)監(jiān)測治療過程中瘢痕厚度的變化。采用免疫組織化學染色法檢測局部真皮內(nèi)CTGF的表達分布，膠原合成（Ⅰ型膠原）以及向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)分化(α-SMA)的情況差異，并采用Masson三色染色法觀察真皮內(nèi)膠原的堆積及排列情況。同時，提取皮膚組織蛋白，采

14、用Western-blot技術(shù)檢測各組皮膚內(nèi)CTGF、Ⅰ型膠原、α-SMA三種蛋白的表達差異。
　　研究結(jié)果:納米粒組裸鼠創(chuàng)面可觀察到紅色熒光并持續(xù)到第5天。大體圖像可見第2周創(chuàng)面基本愈合，之后開始向外增生突起，到第6周增生達到頂峰，B型超聲結(jié)果顯示相比空白對照組和載亂碼RNA殼聚糖納米粒組，三種濃度載siCTGF殼聚糖納米粒組超聲測量值（瘢痕厚度）呈現(xiàn)不同程度下降，有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。組織學結(jié)果顯示治療組真皮內(nèi)CTGF