人體血漿中miR-148a表達(dá)水平與氟伐他汀藥代動力學(xué)的相關(guān)性研究.pdf

1、背景：
　　微小RNA（miRNA）是一類內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，約20~24nt，普遍存在于真核生物中。miRNA通過參與基因轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控，不僅在細(xì)胞分化、增殖、代謝和凋亡等生理病理過程，而且在藥物轉(zhuǎn)運代謝的調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。有研究已表明miR-148a可與核受體PXR3’-UTR的miR-148a識別元件（PXR-MRE-148a）結(jié)合，進而抑制PXR mRNA的翻譯，使得PXR蛋白水平降低，其下游CYP3A4表達(dá)量隨

2、之減少；證明miRNA可通過對靶基因mRNA的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，引起PXR的翻譯抑制，最終減少其下游靶蛋白的表達(dá)。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，同樣作為PXR下游靶基因的OATP1B1的活性隨著PXR表達(dá)的增加而升高且PXR的表達(dá)量受miR-148a轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的影響，即miR-148a確能夠基于PXR介導(dǎo)調(diào)控OATP1B1的表達(dá)。那么國人血漿中miR-148a的分布是否存在差異？若有，此種差異與OATP1B1底物氟伐他汀體內(nèi)藥代動力學(xué)過程是否有關(guān)聯(lián)

3、？確值得我們深入研究，以期為他汀類藥物顯著的個體差異提供新的理論依據(jù)。
　　目的：
　　1.探明人血漿中miR-148a的分布情況；
　　2.探明人血漿中 miR-148a的表達(dá)水平與氟伐他汀主要藥代動力學(xué)參數(shù)之間的關(guān)聯(lián)，以期揭示miR-148a對人體內(nèi)氟伐他汀藥代動力學(xué)的確切影響。
　　方法：
　　1.建立人血漿中miR-148a表達(dá)水平的RT-qPCR檢測方法；
　　2.按臨床試驗方案，招募健康受

4、試者、采集血漿樣本并以 RT-qPCR測定miR-148a的表達(dá)水平；以Shapiro-Wilk test對所得實驗數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗，按血漿中 miR-148a表達(dá)水平進行四分位數(shù)分組，考察組間差異，探明人血漿中miR-148a的分布情況；
　　3.建立人血漿中氟伐他汀LC-MS/MS檢測方法；
　　4.篩選血漿中miR-148a高表達(dá)（△Ct值小于第一四分位數(shù)）和低表達(dá)（△Ct值大于第三四分位數(shù)）的受試者各8人入組氟伐他

5、汀人體藥代動力學(xué)研究；單劑量口服給藥氟伐他汀40mg，LC-MS/MS法測定不同時刻（0，0.25，0.5，0.75，1，1.5，2，3，4，6，8，10，12h）血藥濃度并繪制藥-時曲線；采用DAS2.1求算主要藥代動力學(xué)參數(shù)（AUC0-12、AUC0-∞、Cmax、Tmax、CL、Vd、t1/2），比較miR-148a高、低表達(dá)組間氟伐他汀藥代動力學(xué)特征的差異，揭示人血漿中miR-148a的表達(dá)水平與氟伐他汀藥代動力學(xué)的相關(guān)性。

6、r>　　5.數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析：實驗組的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行兩獨立樣本t檢驗，P<0.05的實驗結(jié)果表明差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.建立了穩(wěn)定的血漿中 miR-148a表達(dá)水平的測定方法：同一樣本批內(nèi)重復(fù)性檢驗結(jié)果分別為9.51±0.11、8.85±0.24和0.74±0.07；批間重復(fù)性檢驗結(jié)果分別是9.90±0.51，8.90±0.91和0.79±0.1

7、0，RSD在±15％以內(nèi)，符合要求。
　　2. Shapiro-Wilk檢驗得statistic=0.98，sig=0.17，P>0.05，即77例健康受試者血漿中 miR-148a表達(dá)水平呈正態(tài)分布；按四分位數(shù)分組，各組 miR-148a表達(dá)水平分別是1.34±0.78，3.70±0.77，5.69±0.66和8.33±1.27，Dunnett’s T3法檢驗顯示各組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.01），提示人體血漿中 miR-

8、148a的表達(dá)水平存在差異。
　　3.建立了血漿中氟伐他汀 LC-MS/MS檢測方法：標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.0320x+0.0066（r=0.9960），線性范圍為0.5-500 ng·mL-1，定量下限為0.5 ng·mL-1；低、中、高三種濃度（1.2，50，400 ng·mL-1）的氟伐他汀批內(nèi)精密度分別是1.17±0.16、49.08±3.68和420.63±17.93 ng·mL-1，批間精密度分別為1.12±0.15，

9、48.76±3.91和411.24±15.23 ng·mL-1，RSD均符合要求（高濃度在±15%以內(nèi)，低濃度在±20%以內(nèi)）；提取回收率分別為81.40±7.14，75.38±4.48，74.73±1.86，都在66%以上；介質(zhì)效應(yīng)及其穩(wěn)定性考察均與生物樣本的測定要求一致。
　　4.篩選出的高、低表達(dá)組中 miR-148a表達(dá)水平分別為0.51±0.38和8.13±0.85，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.01）；DAS2.1求算出m

10、iR-148a高、低表達(dá)組的主要藥代動力學(xué)參數(shù)并比較：AUC0-12分別775.61±136.59、520.53±122.11 ng·h·mL-1，高表達(dá)組明顯高于低表達(dá)組，P<0.01，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；AUC0-∞分別為779.88±137.90、524.43±121.64 ng·h·mL-1，高表達(dá)組明顯高于低表達(dá)組，P<0.01，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；Cmax分別為727.56±150.61、457.86±103.56 ng·mL-

11、1，高表達(dá)組明顯高于低表達(dá)組，P<0.01，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；Vd分別為185.29±70.06、317.12±93.08 L，高表達(dá)組明顯低于低表達(dá)組，P<0.01，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；CL分別為52.81±9.92、79.48±16.25 L·h-1，高表達(dá)組明顯低于低表達(dá)組，P<0.01，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；Tmax分別為0.47±0.21、0.5±0.13 h， P>0.05，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；t1/2分別為2.55±1.13、2.

12、75±0.65 h，P>0.05，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　1. miR-148a在人血漿中的表達(dá)呈正態(tài)分布，且存在較大的個體間差異。
　　2.人血漿中miR-148a的表達(dá)水平與氟伐他汀藥代動力學(xué)過程確有相關(guān)性， miR-148a高表達(dá)組的 AUC0-12、AUC0-∞、Cmax明顯高于低表達(dá)組，而 CL、Vd低于低表達(dá)組，而Tmax、t1/2未見明顯差異。提示miR-148a有可能成為影響氟伐他汀體內(nèi)藥代