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文檔簡介
1、目的:研究資木瓜中所含的幾類活性成分及其含量,建立細胞模型篩選具有抑制肥大細胞脫顆粒作用的活性成分,建立CIA小鼠模型研究篩選出的資木瓜活性成分對該動物模型的作用及機制。
方法:(1)紫外分光光度法檢測資木瓜中總皂苷和總黃酮的含量;(2)高效液相色譜法檢測資木瓜中齊墩果酸和熊果酸的含量;(3)通過系統(tǒng)溶劑法、D101大孔吸附樹脂、正反相硅膠、制備液相等分離法,結(jié)合LC-MS,NMR等現(xiàn)代儀器分析方法分離鑒定資木瓜所含單體成分;
2、(4)通過RBL-2H3細胞脫顆粒實驗篩選具有抑制肥大細胞脫顆?;钚缘某煞侄?;(5)取10周齡DBA/1小鼠28只,隨機均分為4組(n=7):正常組、模型組、低劑量組和高劑量組。使用牛二型膠原和弗氏完全佐劑建立小鼠CIA模型,連續(xù)給藥3周,頸椎脫臼處死小鼠。取小鼠血清、四肢、脾臟,ELISA法檢測血清中TNF-α、IL-2、IL-4含量,四肢脫鈣包埋切片后進行HE染色。脾臟稱重后計算脾指數(shù)。(6)免疫組化法檢測各組小鼠四肢滑膜組織中肥大
3、細胞類胰蛋白酶和Treg細胞FOXP3的表達變化。(7)TUNEL法檢測各組小鼠四肢滑膜組織中滑膜細胞凋亡變化。
結(jié)果:(1)資木瓜產(chǎn)區(qū)五個縣市所產(chǎn)木瓜中總皂苷和總黃酮的含量分別在35.41-58.29 mg/g、4.09-4.69 mg/g之間。齊墩果酸含量在0.60%-0.90%之間,熊果酸含量在0.17%-0.45%之間,齊墩果酸加熊果酸總含量在0.91%-1.07%之間。(2)從資木瓜NBF-50%中分離出單體成分莽草
4、酸丁酯。(3)RBL-2H3細胞脫顆粒實驗顯示NBF-50%對脫顆粒的抑制作用較好。(4)與空白組相比,模型組小鼠四肢的關(guān)節(jié)炎評分和足腫脹度均明顯升高,低劑量組和高劑量組小鼠的關(guān)節(jié)炎評分和足腫脹度也有所升高,但相比于模型組,程度減輕,且高劑量組減輕更明顯。HE染色結(jié)果顯示模型組小鼠關(guān)節(jié)病理破壞嚴重、滑膜有向關(guān)節(jié)腔內(nèi)增生趨勢,而低、高劑量組小鼠呈濃度依賴性的改善。(5)類胰蛋白酶檢測結(jié)果顯示,相對于空白組,模型組小鼠滑膜組織中類胰蛋白酶陽
5、性表達的肥大細胞數(shù)量顯著增多,低、高劑量組小鼠類胰蛋白酶陽性表達的肥大細胞數(shù)量相比模型組回落,且呈劑量依賴性。(6)免疫組化檢測FOXP3表達發(fā)現(xiàn),模型組小鼠滑膜組織中幾乎無FOXP3表達,而低劑量組中出現(xiàn)FOXP3陽性表達,高劑量組中FOXP3陽性表達增加。(7)血清ELISA檢測發(fā)現(xiàn),相比于正常組,模型組小鼠血清TNF-α和IL-2水平顯著升高,低劑量組有所降低、高劑量組顯著降低,而模型組小鼠血清IL-4水平相比正常組降低,給藥組呈
6、劑量依賴性升高。(8)TUNEL檢測小鼠四肢滑膜組織滑膜細胞凋亡結(jié)果顯示,與正常組相比,模型組滑膜細胞凋亡無明顯變化,而低高劑量組滑膜細胞凋亡增加,且高劑量組滑膜細胞凋亡增加更為明顯。
結(jié)論:長陽木瓜中總皂苷和總黃酮的含量分別為46.49 mg/g、4.09 mg/g,五個樣本中長陽木瓜齊墩果酸含量最高,為0.90%,齊墩果酸加熊果酸總含量也最高,為1.07%。在系統(tǒng)分離資木瓜所得成分段中,NBF-50%對RBL-2H3細胞脫
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