桑枝活性成分分離純化及其藥理作用的研究.pdf

1、生物體的內(nèi)環(huán)境無時無刻不在生成自由基，自由基在生物體內(nèi)很容易與蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸反應，引發(fā)氧化修飾作用，成為機體衰老及與衰老相關疾病的主要誘因。同時，隨著年齡的增長，機體的抗氧化防御能力卻在逐漸減弱，與衰老相關的疾病如腫瘤、心血管疾病、糖尿病、白內(nèi)障、老年性癡呆等發(fā)病機會大大增加，所以自由基與衰老相關疾病發(fā)生機制之間的關系，成為了研究的新熱點。
　　 為了最大限度地降低自由基對機體的損害，人們開始尋求抗氧化劑，但人工合成的抗氧

2、化劑具有致癌性等很大的毒副作用。植物體富含黃酮類化合物等活性成分，具有很強的抗氧化活性，是天然、安全的抗氧化劑來源物。為此，植物抗氧化劑的開發(fā)與應用，成為了人們關注的研究領域。
　　 桑枝是桑科植物桑Morus alba L.的干燥嫩枝。《中華人民共和國藥典》記載桑枝具有祛風濕、利關節(jié)、行水之功效，適用于風寒濕痹、四肢拘攣、腳氣浮腫之病癥。臨床上主要用于治療肩臂關節(jié)及手足酸痛麻木、風濕痹痛、癱瘓等多種疾病?，F(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)，桑

3、科桑屬植物具有降血糖、降血壓、抗癌、抗菌、抗病毒、抗炎、鎮(zhèn)痛、抑制花生四烯酸代謝等藥理活性，其藥理活性與其所含有活性成分密切相關。我國桑枝資源非常豐富，但對其利用主要局限于以桑枝藥材原料為主的初級開發(fā)，查明桑枝藥用活性成分和藥理作用，對發(fā)展天然中藥制劑等產(chǎn)品的深度開發(fā)，蘊藏有巨大的發(fā)展空間。本課題以桑枝抗氧化性為中心，采用測定、分離、純化、鑒定等方法，對其中的活性物質(zhì)進行分析，將所分離純化的活性物質(zhì)進行一系列的藥理學實驗，探明其活性物質(zhì)

4、的藥理作用機理，從而為桑枝深度開發(fā)提供科學依據(jù)。主要研究結(jié)果如下：
　　 1、對桑枝中黃酮類化合物提取和測定條件進行優(yōu)化，確立了桑枝過160目，以80％乙醇作為溶劑，超聲波提取20 min,在80℃下回流30 min,重復提取3次，為桑枝黃酮類化合物提取的最佳實驗方案。建立了桑枝黃酮類化合物含量測定的分光光度法，該方法精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性和回收率均符合測試要求。
　　 2、采用正交實驗法對桑枝多糖的測定條件進行優(yōu)化，確

5、立了桑枝過160目，超聲提取40 min,在100℃水浴中提取90 min,操重復2次，為最佳提取方案。對桑枝多糖進行了精制，得到桑枝多糖與葡萄糖對照品的換算因子為4.96。桑枝中富含多糖，其含量在桑枝品種間存在顯著差異，高低相差約1.7倍；在同一品種的不同生長季節(jié)和老嫩程度間，春季新生嫩桑枝中多糖含量〉冬季一年生老桑枝中多糖含量〉春季老桑枝中多糖含量。
　　 3、DNJ本身沒有發(fā)色基團，不能用液相色譜直接測定。本研究采用9-芴

6、基氯甲酸甲酯標記、配有熒光檢測器的反相高效液相色譜法，建立了可檢測大數(shù)量桑枝樣品中DNJ含量的快速、可靠方法。利用正交實驗法，確立了在30℃、pH7下反應50 min為最佳衍生化條件。DNJ含量在桑品種間存在顯著差異，高低相差2.9倍，在同一品種的不同生長季節(jié)和老嫩程度間，冬季桑枝中含量最高，春季老枝中含量次之，春季新生嫩枝中含量最低，表明DNJ在桑枝中具有一定的累積作用。
　　 4、采用蛋白快速分離純化儀與示差檢測器相結(jié)合的方

7、法，分離純化桑枝中的多糖，用液相色譜測定其分子量，用離子色譜分析其單糖組成，用紅外光譜進行結(jié)構(gòu)鑒定。研究結(jié)果表明，桑枝多糖是α-構(gòu)形吡喃醛糖，分子量約為6.5×104,主要由鼠李糖、樹膠醛糖、半乳糖、葡萄糖和木糖組成，它們的摩爾比分別為9.1:24.1:44.1∶12.22∶7.8。
　　 5、對桑枝多糖進行硫酸化、磷酸化、乙?；捅郊姿峄玫剿姆N衍生物，研究其結(jié)構(gòu)與抗氧化活性之間的關系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，衍生化后的多糖的抗氧化活性顯

8、著提高，溫度和酸堿度顯著影響其抗氧化活性，抗氧化活性隨pH值升高而增高，隨著溫度升高而降低。
　　 6、根據(jù)DPPH的液相色譜特點，對桑枝乙醇提取液中的主要抗氧化活性物質(zhì)進行了快速分離純化，確定了桑枝乙醇提取液中的主要抗氧化活性物質(zhì)為氧化芪三酚。此方法簡單、快速、方便，避免了傳統(tǒng)方法的反復操作和活性物質(zhì)的分解。
　　 7、采用在線液相色譜法和液相色譜-電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用法，鑒定桑枝中抗氧化活性成分，確立氧化芪三酚在品種間的分

9、布規(guī)律。桑枝富含有氧化芪三酚，其含量在桑品種間存在顯著差異，高低相差2.3倍。此實驗結(jié)果對于推動桑枝及其制品的開發(fā)利用，具有一定的意義。
　　 8、對從桑枝中分離到的四種活性物質(zhì)——氧化芪三酚、二苯乙烯苷、桑色素和蕓香苷，進行抗氧化活性檢驗，確立它們的結(jié)構(gòu)與抗氧化活性之間的關系。結(jié)果顯示，氧化芪三酚分子中的4和3＇位上的羥基，對于清除超氧離子、羥基自由基和DPPH具有重要作用；桑色素分子中3位上的羥基對于清除超氧離子和羥基自由基

10、有重要的作用，蕓香苷分子中的3位上的糖基對其還原力有重要的作用。
　　 9、用ICR小鼠的血清和肝臟中的生化指標、組織病理學和細胞因子表達，研究桑枝乙醇提取液對四氧嘧啶引起的肝損傷的保護作用。研究結(jié)果表明，桑枝乙醇提取液具有護肝作用，其作用機理主要有以下三點：(1)桑枝提取液作為一種抗氧化劑，直接清除四氧嘧啶產(chǎn)生的自由基；(2)桑枝提取液作為一種金屬絡合劑，通過絡合金屬來抑制自由基的產(chǎn)生，從而降低自由基的損害；(3)桑枝提取液作

11、為糖苷酶的抑制劑，通過降低血糖濃度來抑制抗氧化活性酶的糖基化，從而提高其活性來降低損害。
　　 10、DPPH可以通過提高轉(zhuǎn)氨酶活性、MDA含量和NO水平，并伴隨GSH水平和SOD、CAT、GPx活性的降低，對機體肝臟產(chǎn)生損害，組織病理學觀察和炎癥因子表達的研究結(jié)果進一步證實了DPPH的此毒性。此研究結(jié)果對于建立DPPH的急性肝損傷模型，并以此模型來研究藥物對氧化壓力的相關疾病的治療作用，具有積極的意義。
　　 11、利

12、用硫代乙酰胺的肝損傷模型，研究桑枝中蕓香苷的護肝作用。結(jié)果表明，桑枝中蕓香苷具有明顯的護肝作用，其作用機理有以下四個方面：(1)通過促進核糖體RNA的合成來促使肝細胞再生；(2)作為一種抗氧化劑來清除和調(diào)節(jié)細胞內(nèi)谷胱甘肽的含量；(3)通過穩(wěn)定細胞膜和調(diào)節(jié)通透性來阻止有毒物質(zhì)的進入；(4)抑制星狀肝細胞向纖維原細胞的轉(zhuǎn)變，從而來阻止肝硬化的發(fā)生。
　　 12、利用酒精引起的肝損傷模型，調(diào)查桑枝中氧化芪三酚及其糖苷的護肝作用。結(jié)果表

13、明，氧化芪三酚和二苯乙烯苷能夠通過提高抗氧化活性酶活性和GSH的含量、降低MDA水平、削弱TNF-α表達以及改善小鼠肝組織狀況等，對酒精引起的肝損傷起保護作用；氧化芪三酚的護肝作用顯著高于二苯乙烯苷的護肝作用，這兩種活性物質(zhì)的護肝作用與抗氧化活性密切相關。
　　 13、通過桑枝提取液組分中抗炎活性的篩選，從抗炎活性最強的組分中分離到氧化芪三酚和二苯乙烯苷兩種活性物質(zhì)。采用醋酸引起的扭體實驗、福爾馬林引起的舔足實驗、皮膚毛細管通透