水蛭抗凝血活性成分的分離純化及其活性的初步研究.pdf

1、目的:
　　通過星點設(shè)計-效應(yīng)面優(yōu)化法優(yōu)選水蛭最佳提取工藝，最佳工藝所得粗提取物經(jīng)過DEAE Sephadex A-50、Sephadex G-50凝膠柱層析分離純化獲取較粗提取物抗凝血活性更高的純化產(chǎn)物;為水蛭有效成分制劑的進一步研究提供實驗依據(jù)。
　　方法:
　　水蛭粗提取物的制備:通過星點設(shè)計-效應(yīng)面優(yōu)化法優(yōu)選水蛭粗提取物的最佳提取工藝，以提取時間(h)，加水量（相當(dāng)于藥材倍數(shù)），醇沉濃度(％)，醇沉靜置時間(h

2、)為四個影響因素，共需進行2k+2×k+(2×k-1)=31次（k為因素個數(shù)）提取，同時固定水蛭粗粒的浸泡時間為4h，提取次數(shù)為三次;在進行效應(yīng)面優(yōu)化試驗前，先進行單因素試驗。依據(jù)單因素試驗結(jié)果選取提取時間考察范圍為0.5h～4h，加水量為4倍～12倍，醇沉濃度為40％～80％，醇沉靜置時間為8h～24h。用Mini tab15.0統(tǒng)計軟件包進行效應(yīng)面設(shè)計，同時對各因素進行多元線性回歸和二項模式擬合，優(yōu)選最佳提取工藝。
　　粗提取

3、物凝膠柱層析:粗提取物首先通過陰離子交換柱層析(DEAESephadex A-50)，分離獲取抗凝血活性較水蛭粗粒強的分離產(chǎn)物，活性峰洗脫液透析除鹽收集活性產(chǎn)物，最后進行Sephadex G-50進行進一步的分離純化，進而獲取較粗提取物抗凝血活性更強的活性物。
　　活性成分的測定:按照2010版藥典水蛭項下含量測定方法凝血酶滴定法及血漿復(fù)鈣時間測定粗提取物和分離純化產(chǎn)物的抗凝血活性;另外采用凱氏定氮法測定粗提取物及分離產(chǎn)物的蛋白質(zhì)

4、含量。
　　結(jié)果:
　　1.水蛭粗提取物的最佳提取工藝
　　以抗凝血酶效價為指標(biāo)，優(yōu)選水蛭粗提取物的最佳提取工藝;通過Minitab15.0軟件包的處理分析，得到最佳提取工藝參數(shù)為:提取時間為1.5h，加水量為10倍，醇沉濃度為50％，醇沉靜置時間為20h。
　　2.粗提取物經(jīng)凝膠柱層析
　　①粗提取物首先通過陰離子交換層析（DEAE Sephadex A-50），通過實驗考察確定所用層析柱的尺寸為30cm

5、*1 cm，凝膠填充的高度為25cm，上樣的樣品濃度為106mg/ml（即相當(dāng)于4g水蛭藥材的含量）;在該條件下分離效果較好，分離得到3個活性峰，即為三種活性成分，測得三種活性成分中，峰1具有最高的抗凝血活性，為144.90U/g，峰2為112.84U/g，峰3為81.34U/g。
　?、谶^DEAE Sephadex A-50的洗脫峰1過Sephadex G-50
　　收集過DEAE Sephadex A-50抗凝血活性最強

6、的洗脫峰1，收集洗脫液透析除鹽，透析液低溫60℃真空干燥，得到峰1干燥產(chǎn)品;利用Sephadex G-50對峰1干燥產(chǎn)品進行進一步的分離純化。利用該種凝膠進行分離純化，也需要通過實驗考察確定所用層析柱的尺寸為30cm*1 cm，凝膠填充高度為20cm，上樣的樣品濃度為45mg/ml，在該分離條件下，分離得到一個洗脫峰，收集洗脫峰，透析除鹽，60℃低溫真空干燥，得到干燥產(chǎn)品，測得其抗凝血酶效價為225.28U/g。
　?、鄯蛛x產(chǎn)物血

7、漿復(fù)鈣時間的測定
　　收集各洗脫峰，收集液透析除鹽，低溫60℃真空干燥，分別標(biāo)記為A1、A2、 A3、 G1四種干燥產(chǎn)品，制備各種產(chǎn)品的濃度為5mg/ml，測得它們的血漿復(fù)鈣時間均值分別為（294±4.2）s、(210±4.5)s、(135±3.7)s、(331±4.9)s，各樣品重復(fù)測定十次，生理鹽水作為空白測得為（68±4.6）s，水蛭粗提取物為（234±5.0）s，通過SPSS19.0統(tǒng)計軟件分析，成組t檢驗比較分析，各產(chǎn)品

8、與生理鹽水空白比較，P＜0.05，差異有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義，均能夠延長血漿復(fù)鈣時間。
　　3.凱氏定氮法測定產(chǎn)品的蛋白質(zhì)含量
　　利用凱氏定氮法測定水蛭粉、水蛭粗提取物、過DEAE Sephadex A-50活性峰A1干燥產(chǎn)品、過G-50活性峰G1的蛋白質(zhì)含量，分別測得為57.22g/100g、72.15g/100g、96.34mg/100g、69.87mg/100g。
　　結(jié)論:
　　水提醇沉法是提取水蛭有效成分

9、的最佳提取方法，所得粗提取物的抗凝血酶效價較其它方法的高，通過星點設(shè)計-效應(yīng)面優(yōu)化法獲取水提醇沉的最佳提取工藝，得到抗凝血酶效價更高的粗提取物;所得粗提取物能夠有效的經(jīng)過DEAESephadex A-50凝膠柱的分離純化，所得分離產(chǎn)物活性峰1亦能夠通過SephadexG-50的進一步分離純化，分離得到抗凝血酶效價為112.64U/g的產(chǎn)物;通過水蛭粉提取液、水蛭粗提取物、過A-50/G-50的分離純化產(chǎn)物的體外抗凝血活性測定的實驗發(fā)現(xiàn)推