瑪咖化學(xué)成分分析及其神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制研究.pdf

1、瑪咖是十字花科獨(dú)行菜屬草本植物，被盛譽(yù)為“秘魯人參”，目前我國(guó)云南，新疆，西藏等地區(qū)引種成功，市場(chǎng)瑪咖產(chǎn)品種類(lèi)繁多，由于其產(chǎn)地及品種的不同，且產(chǎn)品多圍繞其壯陽(yáng)功效予以夸大宣傳，導(dǎo)致市場(chǎng)混亂，魚(yú)龍混雜，長(zhǎng)遠(yuǎn)來(lái)看，將會(huì)極大影響瑪咖產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。早期主要研究集中其初生代謝產(chǎn)物。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)瑪咖越來(lái)越多的其它生理作用，對(duì)其次生代謝產(chǎn)物如瑪咖酰胺、瑪咖烯、芥子油苷等及其藥理作用研究逐漸增多。本論文系統(tǒng)闡述了瑪咖的化學(xué)成分并對(duì)其體內(nèi)外神經(jīng)保護(hù)作用及

2、其作用機(jī)制進(jìn)行了初步探討。
　　一.瑪咖化學(xué)成分分離
　　本研究首先對(duì)瑪咖成分進(jìn)行了基本系統(tǒng)分離，分離鑒定了23個(gè)化合物，包括12個(gè)生物堿類(lèi)（7個(gè)瑪咖酰胺類(lèi)生物堿，2個(gè)吡啶類(lèi)生物堿，1個(gè)咔啉類(lèi)生物堿，2個(gè)普通酰胺類(lèi)生物堿），3個(gè)芥子油苷類(lèi)，4個(gè)有機(jī)酸類(lèi)，4個(gè)其他類(lèi)化合物，所分離鑒定的23個(gè)化合物中6個(gè)在本植物中為首次發(fā)現(xiàn)。
　　二.瑪咖化學(xué)成分分析
　　建立了用以分析瑪咖中次生代謝產(chǎn)物的UHPLC-ESI-Orb

3、itrap MS分析方法，總結(jié)了瑪咖酰胺，吡啶類(lèi)、咔啉類(lèi)、咪唑類(lèi)生物堿、芥子油苷、瑪咖烯的多級(jí)質(zhì)譜裂解規(guī)律（吡啶類(lèi)和咔啉類(lèi)生物堿的裂解規(guī)律是首次推導(dǎo)），并運(yùn)用上述裂解規(guī)律鑒定了瑪咖中的159個(gè)化合物。為使峰增加且不同類(lèi)有效成分富集，瑪咖甲醇提取物通過(guò)ODS柱分為6個(gè)組分（Fr1-Fr6）進(jìn)行鑒定和推導(dǎo)，包括64個(gè)瑪咖酰胺類(lèi)、3個(gè)吡啶類(lèi)、38個(gè)咪唑類(lèi)、16個(gè)咔啉類(lèi)生物堿、14個(gè)芥子油苷類(lèi)、11個(gè)瑪咖烯類(lèi)、5個(gè)有機(jī)酸類(lèi)和8個(gè)其他類(lèi)化合物。<

4、br>　　建立了利用液相串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜(UHPLC-ESI-QqQ MS)定量分析瑪咖中的活性成分，運(yùn)用動(dòng)態(tài)多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)(DMRM)技術(shù)定量17個(gè)不同產(chǎn)地，不同類(lèi)型和不同部位的瑪咖中14個(gè)代表性化合物（甲氧基芐基芥子油苷、芐基芥子油苷、對(duì)羥基芐基芥子油苷、N-(3-甲氧基芐基)-十六碳酰胺、N-芐基苯甲酰胺、N-芐基十六碳酰胺、甘草查爾酮、1，2-二氫-4-甲醛-3-苯甲基-N-羥基吡啶、4-甲醛-3-甲氧基芐基-N-吡啶、N-乙

5、酰芐胺、苯乙酰胺、煙酸、琥珀酸、(1R，3S)-1-甲基-β-咔啉-3-甲醛。芥子油苷類(lèi)(10.97～79.84 mg/g)和生物堿類(lèi)(0.54～2.99 mg/g)是瑪咖中的主要成分，并分析比較了國(guó)內(nèi)引種和國(guó)外秘魯原產(chǎn)地，國(guó)內(nèi)產(chǎn)地之間，不同品種及不同部位的差異，表明原產(chǎn)地和國(guó)內(nèi)引種產(chǎn)地的瑪咖有效成分含量是有差別的，芥子油苷類(lèi)和咔啉類(lèi)生物堿在秘魯瑪咖樣品中的含量高于在中國(guó)種植的瑪咖。然而，在中國(guó)種植的瑪咖中有機(jī)酸類(lèi)，吡啶類(lèi)生物堿，普通酰

6、胺類(lèi)生物堿和瑪咖酰胺的含量是高于在秘魯原產(chǎn)地種植的。結(jié)果表明云南種植的瑪咖為成為秘魯原產(chǎn)地可能的替代品提供了依據(jù)，國(guó)內(nèi)不同產(chǎn)地之間云南產(chǎn)的瑪咖次生代謝產(chǎn)物的含量較西藏和新疆地區(qū)的多;對(duì)于不同品種的瑪咖，經(jīng)過(guò)我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)黃瑪咖和紫瑪咖的次生代謝產(chǎn)物含量類(lèi)似，遠(yuǎn)不及市場(chǎng)上宣傳的那樣質(zhì)量有顯著性差異，對(duì)于過(guò)度宣傳的質(zhì)量差異有待進(jìn)一步研究;對(duì)于植株不同部位的瑪咖，瑪咖根中的有效成分是顯著高于葉中的，這可能與瑪咖的生物合成途徑有關(guān)，且葉中也有一

7、定含量的芥子油苷類(lèi)和瑪咖酰胺類(lèi)生物堿，為擴(kuò)大瑪咖資源利用奠定了基礎(chǔ)。
　　三.瑪咖神經(jīng)保護(hù)作用研究
　　本實(shí)驗(yàn)采用MPTP誘導(dǎo)斑馬魚(yú)神經(jīng)損傷模型研究不同組分及單體的神經(jīng)保護(hù)作用，總提取物顯示有神經(jīng)保護(hù)作用，F(xiàn)r4（普通酰胺生物堿，吡啶生物堿），F(xiàn)r5（咪唑生物堿，瑪卡酰胺，瑪咖烯），F(xiàn)r6（瑪咖酰胺）有不同程度的神經(jīng)保護(hù)作用且具有劑量依賴性，尤其是80％乙醇洗脫部位。結(jié)合瑪咖化學(xué)成分分析，F(xiàn)r5和Fr6部位都含有高含量的N-

8、芐基十六碳酰胺(A54)。N-芐基十六碳酰胺且作為單體化合物顯示有顯著地神經(jīng)保護(hù)作用且有劑量依賴性。采用乙酰膽堿酯酶和丁酰膽堿酯酶抑制實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了體外驗(yàn)證，這些發(fā)現(xiàn)表明瑪咖是通過(guò)多巴胺能系統(tǒng)和膽堿能系統(tǒng)之間的協(xié)同作用顯示神經(jīng)保護(hù)作用的?，斂窠?jīng)保護(hù)作用的機(jī)制之一可能是提高腦內(nèi)乙酰膽堿和丁酰膽堿的水平， N-芐基十六碳酰胺作為單體體內(nèi)體外均驗(yàn)證了具有神經(jīng)保護(hù)作用，說(shuō)明瑪咖酰胺類(lèi)化合物確實(shí)是瑪咖起神經(jīng)保護(hù)作用的主要化合物類(lèi)型。
　　為了

9、探討N-芐基十六碳酰胺作用于MPTP誘導(dǎo)的MN9D細(xì)胞的保護(hù)作用，本研究采用MPP+損傷MN9D細(xì)胞建立神經(jīng)損傷體外模型，研究N-芐基十六碳酰胺的保護(hù)作用，篩選MPP+作用于MN9D細(xì)胞的合適造模濃度為500μM，起到神經(jīng)保護(hù)作用的N-芐基十六碳酰胺的合適濃度范圍為50-100μM。500μMMPP+作用MN9D細(xì)胞24 h，細(xì)胞的存活率降低至約50％，從細(xì)胞顯微鏡下也可以看到細(xì)胞形態(tài)的變化，對(duì)照組MN9D細(xì)胞大部分貼壁，大部分細(xì)胞有突

10、起生長(zhǎng)，且逐步向外延伸，模型組500μMMPP+作用MN9D細(xì)胞24h后，細(xì)胞貼壁數(shù)目較少，突起消失，因此選擇此濃度作為本研究的造模濃度; N-芐基十六碳酰胺濃度為100μM時(shí)可顯著減輕MPP+造成的MN9D神經(jīng)元細(xì)胞損傷，倒置顯微鏡下觀察與模型組比較，N-芐基十六碳酰胺給藥組顯示貼壁數(shù)目增多，大部分細(xì)胞有突起生長(zhǎng)恢復(fù)，且逐步向外延伸。說(shuō)明N-芐基十六碳酰胺對(duì)MPTP誘導(dǎo)的MN9D小鼠多巴胺能神經(jīng)元損傷細(xì)胞具有保護(hù)作用。
　　利用

11、UHPLC-ESI-QqQ MS測(cè)定N-芐基十六碳酰胺作用于MPP+誘導(dǎo)的MN9D細(xì)胞損傷前后神經(jīng)遞質(zhì)的含量變化，分別絕對(duì)定量和相對(duì)定量了細(xì)胞上清液和細(xì)胞中的12種和17種神經(jīng)遞質(zhì)，造模后下降，給予N-芐基十六碳酰胺48h后又回升的神經(jīng)遞質(zhì)細(xì)胞上清液中主要有谷氨酸，?；撬?，去甲腎上腺素，膽堿，乙酰膽堿，丁酰膽堿且這些氨基酸類(lèi)、單胺類(lèi)和膽堿類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)呈劑量依賴性關(guān)系。細(xì)胞中主要有谷氨酸，去甲腎上腺素，丁酰膽堿，天冬氨酸，高香草酸也呈劑量依

12、賴性關(guān)系。而對(duì)于細(xì)胞上清液中的5-羥色胺及細(xì)胞中的5-羥色胺和精氨酸呈現(xiàn)模型后上升給藥后又下降的趨勢(shì)，而N-芐基十六碳酰胺對(duì)其余的神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)作用則不明顯。由此可知細(xì)胞上清液和細(xì)胞中谷氨酸，去甲腎上腺素和丁酰膽堿在N-芐基十六碳酰胺給藥后同時(shí)都具有顯著性差異且具有劑量依賴性，尤其是膽堿類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)，推測(cè)機(jī)制N-芐基十六碳酰胺能升高乙酰膽堿和丁酰膽堿的水平與第二部分內(nèi)容結(jié)果相呼應(yīng)，有可能通過(guò)膽堿能系統(tǒng)來(lái)調(diào)節(jié)多巴胺能系統(tǒng)，從而起到神經(jīng)保護(hù)作用

13、。
　　運(yùn)用LTQ-Orbitrap MS分析了N-芐基十六碳酰胺干預(yù)MPP+損傷MN9D細(xì)胞中的差異表達(dá)蛋白。結(jié)果顯示給模型藥后降低給藥后升高且呈劑量依賴性關(guān)系的差異蛋白有142個(gè)，給模型藥后升高給藥后降低且呈劑量依賴性關(guān)系的差異蛋白有209個(gè)，且在Mev.4.9.0軟件分析后ANOVA統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)P小于0.01后，4組共有的差異蛋白60個(gè)，使用uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)其進(jìn)行功能注釋且根據(jù)豐度高的篩選出34個(gè)差異蛋白，參與細(xì)胞過(guò)程的蛋

14、白所占比例較大，KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)顯示其參與細(xì)胞自噬，NF-κB信號(hào)通路，Toll樣受體信號(hào)通路，MAPK信號(hào)通路，EGFR酪氨酸酶抑制劑抗性，p53信號(hào)通路，細(xì)胞程序性凋亡等信號(hào)通路，說(shuō)明N-芐基十六碳酰胺的神經(jīng)保護(hù)作用靶點(diǎn)通路與細(xì)胞過(guò)程炎癥相關(guān)。
　　基于UPLC-Q-TOF系統(tǒng)建立了N-芐基十六碳酰胺對(duì)MPP+神經(jīng)損傷的MN9D細(xì)胞的脂質(zhì)代謝組學(xué)研究方法，將所得數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P13.0軟件進(jìn)行正交偏最小二乘法判別分析(OP

15、LS-DA)，根據(jù)每組數(shù)據(jù)的RSD值需大于30％，同時(shí)從中挑選出VIP＞1.5的代謝物離子，并經(jīng)過(guò)t檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，篩選出與MPP+神經(jīng)損傷相關(guān)且N-芐基十六碳酰胺藥物治療后的差異脂質(zhì)代謝物。正常組找出111個(gè)差異性脂質(zhì)分子，模型組組找出114個(gè)差異性脂質(zhì)分子，給藥組找出115個(gè)差異性脂質(zhì)分子，3組共有的差異性脂質(zhì)分子有108個(gè)，結(jié)果顯示，MPP+神經(jīng)損傷可能與甘油磷脂酰膽堿(PC)，磷脂酰乙醇胺(PE)，鞘磷脂

16、(SM)，磷脂酸(PA)，甘油三酯類(lèi)(TG)代謝密切相關(guān)。
　　綜上所述，瑪咖次生代謝產(chǎn)物主要有瑪咖酰胺，吡啶類(lèi)生物堿，咔啉類(lèi)生物堿，咪唑類(lèi)生物堿，芥子油苷和瑪咖烯等。其中瑪咖酰胺是瑪咖起神經(jīng)保護(hù)作用的主要化合物類(lèi)型，一方面可能通過(guò)提高腦內(nèi)谷氨酸、乙酰膽堿、丁酰膽堿、去甲腎上腺素等神經(jīng)遞質(zhì)的水平，另一方面通過(guò)調(diào)節(jié)某些差異脂質(zhì)分子和蛋白質(zhì)發(fā)揮此作用，具有明顯生物學(xué)意義的差異蛋白質(zhì)和脂質(zhì)分子仍需進(jìn)一步進(jìn)行相關(guān)驗(yàn)證，找出N-芐基十六碳酰