UCP2同向調(diào)控ATP、ROS作用的初步研究.pdf

1、目的：線粒體是細(xì)胞能量代謝的中心，同時(shí)也是細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成的主要部位。解偶聯(lián)蛋白2(uncoupling protein2，UCP2)是1997年發(fā)現(xiàn)的線粒體內(nèi)膜上的質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，廣泛分布于人類及嚙齒類動(dòng)物多種組織器官中。UCP2具有很高的質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)活性，能使質(zhì)子直接進(jìn)入線粒體基質(zhì)而不參與ATP的合成，使氧化磷酸化解偶聯(lián)，ATP合成減少;同時(shí)由于線粒體內(nèi)膜兩側(cè)質(zhì)子梯度降低和呼吸鏈電

2、子漏減少，活性氧產(chǎn)生減少。
　　 UCP2自被發(fā)現(xiàn)以來，對(duì)其抗自由基作用和調(diào)節(jié)能量代謝作用研究較多，但極少數(shù)研究將二者結(jié)合起來。線粒體產(chǎn)生ROS的過程與氧化磷酸化過程一樣是線粒體固有的、必然的和同等重要的功能。根據(jù)UCP2的解偶聯(lián)效應(yīng)，我們提出UCP2同向調(diào)控ATP與ROS理論假設(shè);UCP2解偶聯(lián)效應(yīng)提高，ATP水平降低，同時(shí)因線粒體內(nèi)膜兩側(cè)質(zhì)子梯度降低，膜電位、電子漏降低，ROS的生成也降低;反之，UCP2解偶聯(lián)效應(yīng)降低，AT

3、P水平升高，ROS水平也升高。然而，因解偶聯(lián)效應(yīng)改變引發(fā)的ATP、ROS同向變化，在細(xì)胞功能和抗損傷的作用分析中似有矛盾和不解之處：若UCP2低表達(dá)、解偶聯(lián)效應(yīng)降低，ATP增加但ROS也增加，可能導(dǎo)致細(xì)胞損傷；若UCP2高表達(dá)、解偶聯(lián)效應(yīng)增強(qiáng)，ROS減少但ATP也降低，可能導(dǎo)致細(xì)胞功能降低，對(duì)損傷的耐受能力也會(huì)下降。UCP2到底扮演什么角色？究竟是UCP2高表達(dá)還是低表達(dá)對(duì)細(xì)胞正常功能的維持有利?高水平ATP和低水平ROS在細(xì)胞抗損傷中

4、哪一個(gè)可能有更為重要的作用？本研究同時(shí)關(guān)注UCP2解偶聯(lián)效應(yīng)引起的ATP、ROS水平變化，為UCP2生理意義的探明提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：將正常肝細(xì)胞株Chang Liver作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，用含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，37℃、5%CO2恒溫孵育箱培養(yǎng)，隔天換液一次，0.25%胰酶EDTA消化傳代。常規(guī)培養(yǎng)2-3代后，待細(xì)胞狀態(tài)良好時(shí)開始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。應(yīng)用京尼平(genipin)作為UCP2特異性抑制劑。將

5、細(xì)胞分為四組，分別為對(duì)照組、京尼平25μM組、京尼平50μM組、京尼平100μM組，對(duì)照組正常換液，給藥組分別給與不同濃度的京尼平作用40min后，用熒光分光光度法檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位和細(xì)胞內(nèi)總ROS的含量;用熒光蟲素酶生物發(fā)光法測(cè)定ATP含量；通過免疫細(xì)胞化學(xué)的方法檢測(cè)張氏肝細(xì)胞內(nèi)UCP2的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1．通過免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)，可見張氏肝細(xì)胞內(nèi)陽性染色，表明張氏肝細(xì)胞內(nèi)有UCP2表達(dá)。京尼平作用后，

6、UCP2表達(dá)有減少的趨勢(shì)。
　　 2．給與不同濃度京尼平作用40min后，京尼平處理組與對(duì)照組相比，肝細(xì)胞線粒體膜電位水平顯著升高(P＜0.001)，且具有劑量依賴性。
　　 3．給與不同濃度京尼平作用40min后，京尼平處理組與對(duì)照組相比，肝細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著增加（P＜0.001），且具有劑量依賴性。
　　 4．京尼平作用40min后，京尼平處理組與對(duì)照組相比，肝細(xì)胞內(nèi)ATP水平顯著增加(P＜0.05)。