三種環(huán)境因子對(duì)三解帆蚌外套膜Ca2+代謝和ALP基因表達(dá)的影響.pdf

1、三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)是我國(guó)最主要的育珠母蚌，所產(chǎn)珍珠色澤鮮艷、細(xì)膩光滑，是淡水珍珠生產(chǎn)用的首選蚌種。目前，珍珠產(chǎn)量不斷增長(zhǎng)，但同時(shí)養(yǎng)殖淡水珍珠的質(zhì)量卻日益退化，而其中很重要的原因是目前對(duì)珍珠生長(zhǎng)的分子遺傳機(jī)制的認(rèn)識(shí)不足，特別是對(duì)Ca2+代謝調(diào)控下的珍珠貝和珍珠生長(zhǎng)的分子基礎(chǔ)和機(jī)理的研究目前尚未闡明。開(kāi)展珍珠生長(zhǎng)的分子機(jī)制研究不僅可以促進(jìn)珍珠科學(xué)理論研究的深入發(fā)展，還可以為其產(chǎn)業(yè)發(fā)展中珍珠培育技術(shù)的創(chuàng)新和發(fā)展提供

2、指導(dǎo)，因此是當(dāng)前育珠業(yè)亟待研究的課題之一。
　　 鑒于以上背景，本論文主要包括以下兩部分研究?jī)?nèi)容：
　　 一、三種不同環(huán)境因子對(duì)三角帆蚌鈣代謝影響的研究
　　 本研究采用非損傷微測(cè)技術(shù)(Non-invasivemicro-testtechnology，NMT)和激光共聚焦顯微鏡(Confocallaserscanningmicroscope，CLSM)技術(shù)在細(xì)胞水平上對(duì)三角帆蚌外套膜細(xì)胞外Ca2+的運(yùn)動(dòng)方向與速率

3、、細(xì)胞內(nèi)Ca2+囤積進(jìn)行測(cè)定。試驗(yàn)將3只育珠蚌的外套膜培養(yǎng)組織或細(xì)胞分成3個(gè)組(3個(gè)重復(fù)/組)，每組培養(yǎng)液中分別添加不同濃度的Ca2+(對(duì)照組、0.5、1.25、3mmol/L)、不同濃度的VD3(對(duì)照組、50、100、500IU/L)，及置于不同溫度下(20、26、30℃)培養(yǎng)。
　　 研究結(jié)果表明，添加Ca2+時(shí)，細(xì)胞外Ca2+流動(dòng)方向是從外排逐步變?yōu)閮?nèi)流，并隨濃度增大，Ca2+流動(dòng)速度增大，細(xì)胞內(nèi)部的熒光信號(hào)增強(qiáng)，其中添加

4、3mmol/L組Ca2+內(nèi)流速度最大，細(xì)胞內(nèi)部信號(hào)最強(qiáng)，相比其余組差異顯著(P<0.05)；添加VD3時(shí)，Ca2+的流動(dòng)方向也從外排逐步轉(zhuǎn)變成向外套膜細(xì)胞方向內(nèi)流，并且隨著濃度增加，Ca2+流動(dòng)速度增大，細(xì)胞內(nèi)部的Ca2+熒光信號(hào)增大，其中500IU/L組相比對(duì)照組差異顯著(P<0.05)；溫度對(duì)三角帆蚌外套膜細(xì)胞Ca2+的代謝也有重要作用，隨著溫度的升高，Ca2+運(yùn)動(dòng)方向的變化從外排到內(nèi)流再外排(P<0.05)，細(xì)胞內(nèi)部Ca2+信號(hào)也

5、不斷增強(qiáng)，其中在溫度26℃的條件下，Ca2+內(nèi)流速度最大，細(xì)胞內(nèi)部信號(hào)最強(qiáng)(P<0.05)。
　　 二、三種不同環(huán)境因子對(duì)三角帆蚌堿性磷酸酶(ALP)基因表達(dá)、酶活性性的影響及其與鈣代謝水平的相關(guān)分析
　　 堿性磷酸酶(ALP)與珍珠質(zhì)的形成關(guān)系密切，在鈣轉(zhuǎn)運(yùn)和珍珠生物礦化中起著重要的作用，因此本試驗(yàn)探討了ALP對(duì)三角帆蚌體內(nèi)鈣代謝的影響。試驗(yàn)通過(guò)巢式及3’-RACEPCR技術(shù)獲取ALP基因3’端序列，并進(jìn)行生物信息學(xué)分

6、析，利用熒光Real-timeQ-PCR，運(yùn)用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法分析ALPmRNA在外套膜外表皮、腮、內(nèi)臟團(tuán)、斧足、珍珠囊中表達(dá)水平的差異，以及在不同Ca2+、VD3、溫度培養(yǎng)條件下的ALP表達(dá)差異和酶活性的差異。
　　 試驗(yàn)得到ALP基因3’端序列長(zhǎng)度為924bp堿基，該基因在三角帆蚌珍珠囊內(nèi)表達(dá)量最高，與其他組織比較，有顯著差異(P<0.05)。三種培養(yǎng)條件下的外套膜外表皮組織中ALP基因表達(dá)以及酶活性差異綜合分析表明，高濃度的C