豬三種細胞因子克隆表達及山羊三種細胞因子免疫增強作用的研究.pdf

1、細胞因子是由免疫細胞和非免疫細胞產(chǎn)生的一類具有廣泛生物學活性的異質(zhì)性肽類調(diào)節(jié)因子，在體內(nèi)能激活免疫活性細胞，對免疫應答的產(chǎn)生和調(diào)節(jié)有重要作用。IL-2、IL-4和IFN-γ，具有調(diào)節(jié)細胞和體液免疫、抵抗微生物感染、抗腫瘤等多種生物學功能，對調(diào)節(jié)和增強機體的免疫反應有重要作用。本研究分別成功的構建了山羊和豬的三種細胞因子的真核和原核重組質(zhì)粒，研究了山羊三種細胞因子對口蹄疫滅活苗的免疫增強作用。為以后篩選高效的細胞因子免疫佐劑奠定基礎。

2、r>　　1.豬IL-4和IFN-γ的基因克隆依據(jù)NCBI上豬IL-4的GenBank NM_214123.1登錄號，豬IFN-γGenBankNM213948.1登錄號，設計合成特異性引物，從刀豆素（ConA）刺激的豬外周血淋巴細胞(PBMC)，應用RT-PCR技術擴增出豬IL-4和IFN-γ基因序列，并采用軟件進行生物信息學分析。克隆得到的豬IL-4成熟序列321bp，編碼107個氨基酸;豬IFN-γ基因成熟序列432bp編碼144個

3、氨基酸與已公布的序列同源性分別為99.5％和100％。
　　2.豬三種細胞因子重組蛋白的表達及活性檢測構建了豬三種細胞因子的原核表達載體，并成功的表達了重組蛋白。pET328a(+)-SIL-2的融合蛋白大小為21.4 KD，pET32a(+)-SIL-4融合蛋白為30.3 KD，pET28a(+)-SIFN-γ融合蛋白為18.4 KD。采用親和層析的方法對包涵體進行純化，同時應用梯度透析復性的方式對純化后的蛋白復性，獲得了高純度

4、的重組蛋白。采用MTT法檢測結果顯示重組蛋白對豬外周血淋巴細胞的增殖作用的最佳濃度分別為4μg/mL、8μg/mL。在PK-15/VSV系統(tǒng)檢測IFN-γ的抗病毒活性，結果顯示在PK-15細胞上抑制VSV病毒復制的活性為2.70×103U/mg。
　　3.真核表達系統(tǒng)的構建通過將山羊和豬的IL-2、IL-4、IFN-γ基因分別與真核表達載體pVAX1.0連接，成功獲得重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒免疫小鼠，采用RT-PCR和westen-b