三角帆蚌貝殼珍珠層顏色形成相關(guān)基因的克隆與表達(dá)分析.pdf

1、三角帆蚌是我國(guó)特有的優(yōu)良淡水育珠蚌。顏色是評(píng)價(jià)珍珠質(zhì)量的重要指標(biāo)。供片貝貝殼珍珠層顏色(貝殼內(nèi)殼色)顯著影響珍珠顏色。本研究從珍珠或貝殼珍珠層呈色的直接因素（金屬離子、有機(jī)物和珍珠層結(jié)構(gòu)）著手，以實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的紫色家系三角帆蚌（貝殼珍珠層顏色為紫色）和白色家系三角帆蚌（貝殼珍珠層顏色為白色）為實(shí)驗(yàn)材料，從紫色家系和白色家系三角帆蚌外套膜和珍珠囊比較轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)中篩選得到4個(gè)三角帆蚌貝殼珍珠層顏色形成相關(guān)基因。
　　1．三角帆蚌HcGI

2、FLP基因的克隆與表達(dá)分析
　　克隆得到三角帆蚌兩個(gè)胃內(nèi)因子樣蛋白（gastric intrinsic factor-like protein，GIFLP）基因（HcGIFLP1和HcGIFLP2），并進(jìn)行熒光定量、原位雜交及原核表達(dá)實(shí)驗(yàn)。HcGIFLP1基因cDNA全長(zhǎng)619bp，編碼140個(gè)氨基酸；HcGIFLP2基因cDNA全長(zhǎng)821bp，編碼148個(gè)氨基酸，GenBank登錄號(hào)分別為KR822703和KR822704。Hc

3、GIFLP1和HcGIFLP2基因編碼的多肽N端均含有一段由23個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域，核苷酸序列和氨基酸序列相似度均較高。熒光定量結(jié)果顯示，HcGIFLP1基因主要在肝胰腺中表達(dá)，并且在紫色蚌中的表達(dá)量極顯著高于白色蚌（P<0.01）。HcGIFLP2基因主要在外套膜中表達(dá)，在紫色蚌后端緣膜中的表達(dá)量極顯著高于白色蚌（P<0.01）。原位雜交結(jié)果顯示，HcGIFLP1和HcGIFLP2基因在外套膜中的表達(dá)部位基本相同，雜交

4、信號(hào)主要出現(xiàn)在外套膜緣膜的外上皮細(xì)胞，邊緣膜中褶的外上皮細(xì)胞中也有一些信號(hào)。原核表達(dá)結(jié)果顯示，兩個(gè)基因的重組蛋白均主要以包涵體的形式存在。根據(jù)兩個(gè)基因的氨基酸序列設(shè)計(jì)多肽制備多克隆抗體，并用原核表達(dá)純化蛋白檢測(cè)抗體的特異性，結(jié)果顯示HcGIFLP1蛋白的抗體特異性較好，只能檢測(cè)到自身的重組蛋白，HcGIFLP2蛋白的抗體未能檢測(cè)到自身及HcGIFLP1的重組蛋白。
　　2．三角帆蚌HcCUBDC基因的克隆與表達(dá)分析
　　克隆

5、得到三角帆蚌一個(gè)CUB結(jié)構(gòu)域包含蛋白（CUB domain containing protein，CUBDC）基因HcCUBDC，并進(jìn)行熒光定量和原位雜交檢測(cè)分析。HcCUBDC基因cDNA全長(zhǎng)5158 bp，編碼639個(gè)氨基酸，GenBank登錄號(hào)為KP067952。HcCUBDC蛋白含有4個(gè)CUB結(jié)構(gòu)域，屬于CUB超家族，N端含有一段由19個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域。熒光定量結(jié)果顯示，HcCUBDC基因在各個(gè)組織中均有表達(dá)，

6、其中肝胰腺中表達(dá)量最低。在紫色蚌中，后端緣膜表達(dá)量極顯著高于前端緣膜（P<0.01）；在白色蚌中，前端和后端緣膜之間表達(dá)差異不顯著。HcCUBDC基因在紫色蚌后端緣膜中表達(dá)量極顯著高于白色蚌（P<0.01），在紫色和白色蚌前端緣膜中表達(dá)差異不顯著。外套膜原位雜交結(jié)果顯示，HcCUBDC基因主要在外套膜緣膜外上皮細(xì)胞中表達(dá)。
　　3．三角帆蚌HcCA2基因的克隆與表達(dá)分析
　　克隆得到了三角帆蚌一個(gè)碳酸酐酶（carbonic

7、anhydrase，CA）基因HcCA2基因，并進(jìn)行熒光定量和原位雜交檢測(cè)分析。HcCA2基因cDNA全長(zhǎng)1770bp，編碼332個(gè)氨基酸，GenBank登錄號(hào)為KR822705。HcCA2蛋白含有1個(gè)CA結(jié)構(gòu)域，屬于α-CA超家族，N端含有一段由18個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域。熒光定量PCR結(jié)果顯示，HcCA2基因主要在外套膜中表達(dá)，在其他組織中表達(dá)量很低。在紫色蚌中，后端緣膜表達(dá)量極顯著高于前端緣膜（P<0.01）；在白色蚌

8、中，前端和后端緣膜之間表達(dá)差異不顯著。HcCA2基因在紫色蚌后端緣膜中的表達(dá)量極顯著高于白色蚌（P<0.01），在紫色和白色蚌前端緣膜中的表達(dá)差異不顯著。在珍珠形成過(guò)程中，插片后的前19天該基因表達(dá)量很低，19天之后表達(dá)量顯著升高并維持在同一水平。貝殼修復(fù)過(guò)程中，該基因在對(duì)照組中表達(dá)不穩(wěn)定，在前7個(gè)時(shí)間點(diǎn)處理組中的表達(dá)量均極顯著低于對(duì)照組（P<0.01），在后7個(gè)時(shí)間點(diǎn)處理組幾乎不表達(dá)。原位雜交結(jié)果顯示，HcCA2基因在外套膜內(nèi)外上表皮