心肌細(xì)胞縫隙連接傳遞大分子物質(zhì)及其功能.pdf

1、【背景】
　　縫隙連接是位于心肌細(xì)胞之間閏盤(pán)部位的一種非選擇性物質(zhì)交換通道，允許小于1 kDa的小分子物質(zhì)，例如離子、第二信使分子等通透，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞漿的部分物質(zhì)交換與信息傳遞。近年來(lái)隨著對(duì)縫隙連接研究的深入，發(fā)現(xiàn)縫隙連接依賴(lài)其可以通透物質(zhì)的特性，參與了多種生理和病理過(guò)程，例如縫隙連接可以影響細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄翻譯過(guò)程，改變蛋白表達(dá)水平與種類(lèi)，促進(jìn)凋亡信號(hào)的擴(kuò)散，增加心肌梗死面積，影響細(xì)胞周期等。用小分子物質(zhì)的通透很難解釋縫隙連接的這些功能，

2、因此，我們推測(cè)縫隙連接的通透特性不僅限于小于1 kDa的物質(zhì)，此通道可能允許大分子物質(zhì)的通透。本課題采用多種實(shí)驗(yàn)方法，系統(tǒng)地研究了縫隙連接的通透特性，以及大分子物質(zhì)通過(guò)縫隙連接在細(xì)胞間交換的作用。
　　【目的】
　?。?）獲得大量具有功能性縫隙連接的連體心肌細(xì)胞。
　?。?）顯微注射檢測(cè)心肌細(xì)胞縫隙連接的物質(zhì)通透性，以及通道孔徑。
　　（3）研究縫隙連接對(duì)心肌細(xì)胞死亡信號(hào)和生長(zhǎng)信號(hào)傳遞的作用。
　　【方法】

3、
　　本研究主要采用顯微注射的方法，將一系列分子量不同、體積不同的熒光分子注入連體心肌細(xì)胞內(nèi)，觀察分子的擴(kuò)散過(guò)程，間接測(cè)定心肌縫隙連接的通透性及通道孔徑尺寸。隨后建立在體心肌梗死、離體心肌梗死模型，檢測(cè)縫隙連接在細(xì)胞序貫死亡中的作用；建立心臟肥大模型、新生大鼠原代心肌細(xì)胞肥大模型，檢測(cè)縫隙連接在細(xì)胞生長(zhǎng)中的作用；構(gòu)建病毒載體，感染心肌細(xì)胞，研究大分子物質(zhì)經(jīng)縫隙連接在培養(yǎng)細(xì)胞間的擴(kuò)散過(guò)程與作用。
　　【結(jié)果】
　?。?）

4、改進(jìn)實(shí)驗(yàn)方法，獲得具有功能性縫隙連接的連體心肌細(xì)胞
　　酶消化法急性分離成年大鼠心肌細(xì)胞，可以獲得大量高質(zhì)量的單個(gè)長(zhǎng)桿狀心肌細(xì)胞，縫隙連接結(jié)構(gòu)與功能均遭到破壞，不能滿足本實(shí)驗(yàn)的要求。為了獲得與生理狀態(tài)基本一致的縫隙連接，本研究通過(guò)改變酶消化過(guò)程中液體 Ca2+濃度，增加液體中Ca2+濃度，并在5~10μmol/L范圍內(nèi)微調(diào)，同時(shí)全程維持液體的pH值（7.35~7.45）在恒定范圍，可以使部分閏盤(pán)在消化過(guò)程中保持完整，消化結(jié)束后獲得

5、大量的連體心肌細(xì)胞。顯微注射熒光分子碘化丙啶（PI，分子量668 Da）和縫隙連接阻斷劑octanol孵育細(xì)胞，兩個(gè)實(shí)驗(yàn)證實(shí)連體心肌細(xì)胞間的縫隙連接功能正常，沒(méi)有受到酶消化處理的影響產(chǎn)生功能失調(diào)，因此可以采用酶消化法獲得的連體心肌細(xì)胞，針對(duì)縫隙連接的結(jié)構(gòu)與功能開(kāi)展下一步的研究。
　?。?）縫隙連接可以通透大分子物質(zhì)，但是對(duì)物質(zhì)的通透性受到多種因素的影響
　　免疫熒光方法確定心室肌表達(dá)的縫隙連接蛋白（connexin）亞型包括

6、Cx40、Cx43、Cx45，心室肌縫隙連接是由12個(gè)connexin亞基組成的異源復(fù)合體。在現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)方法不能直接檢測(cè)心肌細(xì)胞縫隙連接通透性的情況下，本課題采用顯微注射熒光分子的方法間接測(cè)定縫隙連接的通透性。分別向一個(gè)心肌細(xì)胞內(nèi)注射熒光分子10 kDa、40 kDa、70 kDa、150 kDa、250 kDa或2000 kDa的Dextran-FITC，熒光顯微鏡觀察熒光分子在連體細(xì)胞間的擴(kuò)散過(guò)程，證實(shí)縫隙連接可以通透小于150 k

7、Da的Dextran-FITC，但是隨著分子量的增加，熒光分子的擴(kuò)散速度越來(lái)越慢，說(shuō)明分子量的大小影響物質(zhì)的通透性；為觀測(cè)蛋白分子的擴(kuò)散特性，顯微注射紅色熒光蛋白(RFP)進(jìn)入細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)RFP也可以順利通過(guò)縫隙連接，但是擴(kuò)散速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)慢于同等分子量的Dextran-FITC，說(shuō)明物質(zhì)的電荷數(shù)和空間構(gòu)象也會(huì)對(duì)物質(zhì)的通透性產(chǎn)生影響。根據(jù)已知熒光分子Dextran-FITC的直徑，可以估測(cè)出心肌縫隙連接的孔徑約為17 nm。
　?。?）縫

8、隙連接可以介導(dǎo)死亡信號(hào)和細(xì)胞生長(zhǎng)信號(hào)的傳導(dǎo)
　　縫隙連接可以促進(jìn)死亡信號(hào)的擴(kuò)散。分別構(gòu)建在體、離體心肌梗死模型，本研究發(fā)現(xiàn)在心肌梗死危險(xiǎn)區(qū)，縫隙連接保持開(kāi)放，會(huì)導(dǎo)致死亡信號(hào)從壞死心肌細(xì)胞蔓延至存活心肌細(xì)胞，細(xì)胞結(jié)構(gòu)首先從一端開(kāi)始破壞，出現(xiàn)肌節(jié) Z線附近電子密度降低，線粒體腫脹，肌纖維斷裂，逐漸向整個(gè)細(xì)胞擴(kuò)散，最終導(dǎo)致整個(gè)細(xì)胞壞死。再灌注損傷過(guò)程中多種因素（缺氧、鈣超載、酸中毒）會(huì)降低縫隙連接的通透性，促進(jìn)縫隙連接關(guān)閉，可以阻斷死亡

9、信號(hào)的傳遞，使存活的心肌細(xì)胞得以保持活性，減少死亡細(xì)胞數(shù)量，降低心肌梗死面積。
　　縫隙連接可以介導(dǎo)生長(zhǎng)信號(hào)的傳遞。建立心臟壓力后負(fù)荷模型-腹主動(dòng)脈縮窄，分別觀察1d、8W、16W的心肌肥厚程度，發(fā)現(xiàn)閏盤(pán)雙側(cè)的心肌細(xì)胞生長(zhǎng)速度保持一致；肥大因子ET-1刺激新生大鼠原代培養(yǎng)細(xì)胞，48 h測(cè)定細(xì)胞表面積，重點(diǎn)測(cè)定保持相互接觸的細(xì)胞面積，因?yàn)檫@類(lèi)細(xì)胞之間存在縫隙連接，發(fā)現(xiàn)相互接觸的細(xì)胞表面積沒(méi)有差異，沒(méi)有相互接觸的細(xì)胞之間表面積差別很大

10、；結(jié)合這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果證實(shí)，縫隙連接可以介導(dǎo)生長(zhǎng)信號(hào)的傳遞，協(xié)調(diào)細(xì)胞之間的生長(zhǎng)。構(gòu)建慢病毒載體感染新生大鼠心肌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)蛋白分子 EGFP從感染病毒的細(xì)胞擴(kuò)散至未被病毒感染的細(xì)胞，證實(shí)大分子物質(zhì)增強(qiáng)綠色熒光蛋白(EGFP)可以在相互接觸的細(xì)胞之間擴(kuò)散，進(jìn)一步提供了縫隙連接可以通透大分子物質(zhì)的證據(jù)。
　　【結(jié)論】
　　心肌細(xì)胞縫隙連接可以通透小于150 kDa的大分子物質(zhì)，通道孔徑大約為17 nm。因?yàn)閷?duì)大分子物質(zhì)的通透特性，