EGCG對高糖環(huán)境下大鼠心肌細胞縫隙連接的影響及其機制探討.pdf

1、目前糖尿病在全世界患病人數(shù)已超過2.2億。糖尿病的心血管風險已被廣泛認知，例如冠心病和糖尿病心肌病。由于糖尿病患者具有較高的心律失常發(fā)生率，容易出現(xiàn)房顫、室顫甚至猝死，越來越多的研究開始關(guān)注糖尿病導(dǎo)致心律失常的發(fā)病機制。在心臟電機械活動中，心肌細胞之間的電偶聯(lián)和有序的電傳導(dǎo)依賴于縫隙連接的功能。許多研究提示縫隙連接表達或功能的變化會引起電傳導(dǎo)的紊亂和心律失常的發(fā)生。因此，糖尿病患者中心肌細胞縫隙連接的變化可能與其心律失常并發(fā)癥直接相關(guān)，

2、目前認為，Cx43是心室肌細胞最主要的縫隙連接蛋白，而Cx40和Cx45在心房肌和傳導(dǎo)系統(tǒng)中也有少量的表達。Cx43蛋白表達的變化或重分布將為各種心律失常提供致病基礎(chǔ)。
　　 在糖尿病患者中，心血管并發(fā)癥被認為主要是高血糖誘發(fā)的。然而，隨著病程的發(fā)展，許多混雜因素比如晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)和高脂血癥逐漸出現(xiàn)，它們可能會引起與單一高血糖作用不一樣的表現(xiàn)。最近的一些研究發(fā)現(xiàn)，在STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型中，誘導(dǎo)3周后的大鼠心臟

3、Cx43表達下降，而誘導(dǎo)12周后的Cx43表達增加。對于不一致的實驗結(jié)果我們不能排除除了高糖以外，還有其他因素也能作用于Cx43的表達。所以，我們在本實驗中將探討單純高糖對心肌細胞縫隙連接的影響及其機制，這在國內(nèi)外尚缺乏相關(guān)報道。
　　 表沒食子兒茶素沒食子酸脂(EGCG)，是綠茶提取物茶多酚的主要組成成分。近來發(fā)現(xiàn)EGCG在心血管疾病中有著廣泛的保護作用。它能夠改善缺血再灌注誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡，改善心肌肥大和氧化應(yīng)激。有研究發(fā)

4、現(xiàn)它能保護糖尿病大鼠的胰腺β細胞。在MDCK細胞，EGCG能改善DMSO對Cx43的抑制效應(yīng)。但是，少有報道提及EGCG對心肌細胞Cx43的作用及其機制。
　　 因此，基于上述考慮，我們在本研究中首先觀察了高糖處理對心肌細胞縫隙連接蛋白的表達影響，然后探討了EGCG共處理是否能改善高糖環(huán)境下心肌細胞縫隙連接的表達和功能，并研究了其作用機制，最后，我們在STZ誘導(dǎo)的早期糖尿病大鼠模型中，用EGCG干預(yù)后探討其保護作用。
　　

5、 1、高糖環(huán)境對大鼠心肌細胞縫隙連接的影響及其機制
　　 目的：探討高糖環(huán)境對大鼠心肌細胞縫隙連接的影響及其機制。
　　 方法：取2天齡SD乳鼠，分離心肌細胞培養(yǎng)，培養(yǎng)5天后予以30mM高糖處理。Westernblot檢測Cx43表達變化；realtimePCR觀察Cx43mRNA的變化。劃痕染料傳輸試驗觀察縫隙連接功能的改變。然后Westernblot檢測高糖干預(yù)后P-PKC/PKC、P-Erk/Erk、P-P38/

6、P38、P-JNK/JNK等信號通路蛋白的變化。隨后加入PKC抑制劑(GF109203X)和Erk抑制劑(PD98059)等信號通路抑制劑預(yù)處理心肌細胞30min后，再予以高糖干預(yù)，Westernblot檢測Cx43表達的變化。
　　 結(jié)果：高糖干預(yù)后Cx43表達顯著下降，72h達到平臺期，縫隙連接功能也受到顯著抑制。但Cx43mRNA未見改變。加入蛋白酶抑制劑leupeptin預(yù)處理30min后，高糖對Cx43的下調(diào)作用被逆轉(zhuǎn)

7、，高糖可呈時間依賴性的激活P-PKC和P-Erk，分別在7.5min和15min達到最高峰，隨后回落，但對P-P38和P-JNK激活不明顯。加入PKC和Erk抑制劑預(yù)處理后，PKC抑制劑可顯著抑制高糖對Cx43的下調(diào)。
　　 結(jié)論：高糖環(huán)境下心肌細胞的Cx43蛋白表達顯著下降，縫隙連接功能受到抑制，但Cx43mRNA未見改變。PKC途徑可能參與了高糖對心肌細胞Cx43的下調(diào)。
　　 2、EGCG對高糖下調(diào)的心肌細胞縫隙連

8、接的作用以及相關(guān)機制
　　 目的：探討EGCG共處理對高糖下調(diào)的心肌細胞縫隙連接的作用以及相關(guān)機制
　　 方法：取2天齡SD乳鼠，分離心肌細胞后予以高糖培養(yǎng)72h，并加入EGCG共處理(不同時間和不同濃度)，Westernblot、realtime-PCR和免疫熒光檢測心肌細胞縫隙連接蛋白的表達。劃痕染料傳輸實驗觀察縫隙連接功能的改變。Westernblot檢測EGCG對信號通路蛋白表達的影響，隨后加入相應(yīng)信號通路抑制劑

9、預(yù)處理30min，觀察EGCG對Cx43表達的影響。
　　 結(jié)果：EGCG呈時間依賴和濃度依賴的改善高糖對心肌細胞Cx43蛋白表達的下調(diào)，以40μM和24h共處理效果最明顯；劃痕染料傳輸實驗提示EGCG共處理24h后被高糖抑制的縫隙連接功能得到改善。但EGCG和高糖對Cx40和Cx45均無明顯作用，對Cx43mRNA的表達也無顯著改變。Westernblot提示EGCG能激活P-Erk、P-P38、P-JNK，在15min到達高

10、峰，但對P-PKC無明顯激活作用。加入相應(yīng)的信號通路抑制劑預(yù)處理30min后，發(fā)現(xiàn)P38抑制劑(SB203580)能抑制EGCG對Cx43的保護作用。
　　 結(jié)論：EGCG能顯著改善高糖對心肌細胞Cx43的下調(diào)作用，恢復(fù)縫隙連接功能。P38MAPK途徑可能參與了EGCG對心肌細胞Cx43的保護作用。
　　 3、EGCG對早期糖尿病大鼠心肌細胞縫隙連接蛋白的影響
　　 目的：探討EGCG對早期糖尿病大鼠心肌細胞縫隙

11、連接蛋白的影響。
　　 方法：取SD健康雄性大鼠，一次性腹腔注射STZ60mg/kg誘導(dǎo)糖尿病模型，分為正常對照組，糖尿病組，糖尿病加EGCG干預(yù)組(50mg/kg/d，ig)。21天后免疫組化觀察心肌細胞Cx43蛋白的表達改變和分布。
　　 結(jié)果：早期糖尿病大鼠的心肌細胞Cx43表達減少，呈顆粒狀散在分布，失去連貫結(jié)構(gòu)，而EGCG干預(yù)后表達得到明顯改善，分布向閏盤集中，結(jié)構(gòu)有序連貫。
　　 結(jié)論：EGCG能顯著