雞α干擾素基因及其下游基因Mx的研究.pdf

1、雞α干擾素是雞免疫相關(guān)細(xì)胞產(chǎn)生的一種高活性、多功能的生物活性糖蛋白,具有抗病毒活性。雞α干擾素基因在受到禽流感病毒、新城疫病毒等外源物刺激后表達(dá),然后誘導(dǎo)其下游抗病毒蛋白(AVP)基因表達(dá),一起發(fā)揮抗病毒活性。其中Mx基因是一種十分重要的干擾素激活基因(ISG),所編碼的Mx蛋白是目前國際上最為廣泛研究的幾種抗病毒蛋白之一。鑒于此,本研究對雞α干擾素及其下游基因Mx展開研究,為控制和治療禽類致病性病毒感染提供新的思路和手段。
　　

2、本研究選用H9N2 G1-like亞型禽流感病毒對健康6周齡雛雞進(jìn)行攻毒,攻毒3天后處死,取肺部提取總RNA,采用RT-PCR克隆雞α干擾素(ChIFN-α)基因,構(gòu)建原核表達(dá)重組質(zhì)粒ChIFN-α-pGEX-5X3,經(jīng)酶切鑒定,DNA測序等證實(shí)重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。其序列全長489 bp,與IFNA3(Accession: X92478)核苷酸序列相似性高達(dá)99％,說明雞α干擾素基因相對保守。將ChIFN-α-pGEX-5X3轉(zhuǎn)化Rose

3、tta(DE3)plysS宿主菌,IPTG誘導(dǎo), SDS-PAGE和Western-blotting印跡分析表明其表達(dá)產(chǎn)物為45 kDa左右的融合蛋白。
　　在此基礎(chǔ)之上,本研究進(jìn)一步采用上述技術(shù)路線克隆雞α干擾素下游基因Mx(ChMx),分別構(gòu)建原核表達(dá)重組質(zhì)粒 ChMx-pGEX-4T3和真核表達(dá)重組質(zhì)粒ChMx-pEGFP-N1,經(jīng)酶切鑒定, DNA測序等證明重組質(zhì)粒構(gòu)建準(zhǔn)確無誤。繼而將ChMx-pGEX-4T3轉(zhuǎn)化 Ros

4、etta(DE3)plysS宿主菌, IPTG誘導(dǎo), SDS-PAGE和Western-blotting印跡證實(shí)Mx表達(dá)產(chǎn)物為94 kDa左右的融合蛋白。最后割膠回收重組蛋白,與弗氏佐劑混勻制作免疫原,對SPF新西蘭大白兔進(jìn)行三次免疫(第一次為弗氏完全佐劑,后續(xù)為弗氏不完全佐劑),獲得效價為1:400的多克隆抗體。
　　對本課題組成功克隆到的雞Mx基因編碼的氨基酸序列與GenBank登陸的雞和鴨的Mx基因編碼的氨基酸進(jìn)行多重比對,