蘇云金芽孢桿菌cry1Ac與蛛毒蛋白酶抑制劑基因hwtx-11融合表達(dá)及其功能研究.pdf

1、蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis，簡(jiǎn)稱 Bt)是目前世界上應(yīng)用范圍最廣的殺蟲(chóng)微生物。但是野生型的Bt菌株存在殺蟲(chóng)譜窄、毒力低等缺點(diǎn)，因此必須通過(guò)現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建高效廣譜的Bt 工程菌來(lái)滿足生產(chǎn)的需要。本研究利用融合基因技術(shù)將蘇云金芽孢桿菌crylAc基因與蛛毒蛋白酶抑制劑基因hwtx-11融合獲得了毒力高、殺蟲(chóng)譜廣的工程菌株，并且對(duì)其功能進(jìn)行了初步的研究。 1．crylAc基因與蛛毒蛋白酶抑制劑

2、基因hwtx-11 融合基因的構(gòu)建 利用Bt偏愛(ài)密碼子優(yōu)化設(shè)計(jì)虎紋捕鳥(niǎo)蛛(Selenocosmia huwena)蛛毒蛋白酶抑制劑基因hwtx-11和腸激酶位點(diǎn)序列(Enterokinase site，簡(jiǎn)稱EK site)，然后進(jìn)行化學(xué)合成。對(duì)合成片段進(jìn)行磷酸．化退火連接，與經(jīng)Bgl Ⅱ和MifeⅠ雙酶切的含crylAc的目的片段相連接，獲得pUA11中間質(zhì)粒，經(jīng)SalⅠ和BamHⅠ雙酶切，將融合基因片段克隆進(jìn)穿梭載體pHT31

3、5中，獲得表達(dá)載體pHA11。將表達(dá)載體pHA11電轉(zhuǎn)化無(wú)晶體突變株Cry<'->B，獲得重組菌株BHA11。同樣，將攜帶crylAc基因的表達(dá)載體pHAc電轉(zhuǎn)化無(wú)晶體突變株Cry<'->B，獲得對(duì)照株BHAc。經(jīng)SDS-PAGE和Westem blot分析，CrylAc-HWTX-11 融合蛋白在無(wú)晶體突變株中得到表達(dá)，其相對(duì)分子量約為136.6 kDa。對(duì)甜菜夜蛾(Spodoptera exigua Hubner)和棉鈴蟲(chóng)(Heli

4、coverpa armigera)幼蟲(chóng)進(jìn)行的生測(cè)結(jié)果顯示，BHA113d的LC<,50>值分別為12.3μg/ml和23.7μg/ml，BHAc 3d的LC<,50>值分別為19.1μg/ml和30.6μg/ml，BHA11菌株的殺蟲(chóng)毒力是BHAc菌株的1.6倍和1.3倍。 2.CrylAc C-端缺失對(duì)融合表達(dá)的影響 將攜帶融合基因的pHA11質(zhì)粒進(jìn)行Xho Ⅰ和Bgl/Ⅱ酶切，然后分別用 T4 DNA 聚合酶和綠豆芽

5、核酸酶補(bǔ)平，構(gòu)建缺失1.7kb crylAc C-端的重組質(zhì)粒 pHA11T。將表達(dá)載體 pHA11T 電轉(zhuǎn)化無(wú)晶體突變株Cry<'->B，獲得重組菌株 BHA11T。經(jīng) SDS-PAGE 和 Western blot 分析，pHA11T在無(wú)晶體突變株中得到表達(dá)，BHA11T表達(dá)的融合蛋白相對(duì)分子量約為74.3 kDa。生測(cè)結(jié)果顯示，BHA11T對(duì)甜菜夜蛾和棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)具有殺蟲(chóng)活性，其LC<,50>值分別為34.7μg/ml 和 63.7

6、μg/ml，與BHAc 菌株相比，BHA11T 菌株毒力分別降低了0.8倍和1.1倍。 3.CrylAc與蛋白酶抑制劑HWTX-11 的協(xié)同作用 將化學(xué)合成的蛛毒蛋白酶抑制劑基因 hwtx-11 克隆至載體pGEX4T-1上，在大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá)。重組菌株在IPTG誘導(dǎo)下，經(jīng)SDS-PAGE和Western blot分析表明，表達(dá)的GST-HWTX-11 融合蛋白的相對(duì)分子量約為33 kDa。對(duì)重組菌株

7、誘導(dǎo)表達(dá)后的產(chǎn)物進(jìn)行生物活性測(cè)定，GST-HWTX-11 融合蛋白對(duì)甜菜夜蛾和棉鈴蟲(chóng)在3d時(shí)的LC<,50>分別為86.6μg/ml 和 119.4μg/ml；其與CrylAc 對(duì)甜菜夜蛾和棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)毒力也有明顯的協(xié)同作用。 為了在蘇云金桿菌中高效表達(dá)crylAc和hwtx-11的融合基因，本研究在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)上進(jìn)行了多重優(yōu)化。首先，采用crylAc基因的BtⅠ、BtⅡ雙重疊啟動(dòng)子來(lái)啟動(dòng)融合基因的表達(dá)。該啟動(dòng)子是蘇云金桿菌中最普遍存

8、在的一類強(qiáng)啟動(dòng)子，適合在無(wú)晶體突變株Cry<'->B中啟動(dòng)融合基因的表達(dá)。其次，我們保留了crylAc基因終止子下游區(qū)中的莖環(huán)結(jié)構(gòu)和Poly (T)結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中能有效終止轉(zhuǎn)錄并使mRNA更穩(wěn)定，延長(zhǎng)rnRNA的半衰期，保證了融合蛋白高效穩(wěn)定的表達(dá)。同時(shí)，為了將真核來(lái)源的hwtx-11基因在Bt中表達(dá)并發(fā)揮作用，我們采用Bt偏愛(ài)密碼子對(duì)hwtx-11的編碼序列進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，并在融合基因間插入了腸激酶位點(diǎn)的編碼序列，以使融合蛋白

9、在昆蟲(chóng)中腸能降解成有活性的CrylAc 和HWTX-11 蛋白。此外，本研究構(gòu)建了重組菌株BHA11T來(lái)研究CrylAc C-端對(duì)融合蛋白表達(dá)的影響。生測(cè)結(jié)果顯示其毒力比對(duì)照菌株BHA11有所降低，可能是因?yàn)镃rylAc C-端富含半胱氨酸，而缺失CrylAc C-端的融合蛋白在表達(dá)時(shí)，不能形成二硫鍵，不能很好地形成晶體，從而很容易被降解。研究了HWTX-11與CrylAc的協(xié)同作用，它們之間具有良好的協(xié)同作用，這是由于它們的殺蟲(chóng)機(jī)制不