蘇云金芽胞桿菌Cry1Ac毒素對棉鈴蟲作用機(jī)理的研究.pdf

1、蘇云金芽胞桿菌（Bacillusthuringiensis，簡稱Bt）是一種分布廣泛的革蘭陽性細(xì)菌，伴隨芽胞形成產(chǎn)生殺蟲晶體蛋白（Insecticidalcrystalproteins，簡稱ICPs），能夠毒殺包括鱗翅目、雙翅目、鞘翅目等九個(gè)目的500多種昆蟲，被廣泛應(yīng)用于害蟲防治。棉鈴蟲是世界性重要農(nóng)業(yè)害蟲，隨著Bt殺蟲劑的廣泛使用和轉(zhuǎn)基因棉花的廣泛種植，棉鈴蟲的抗性問題已經(jīng)成為制約生物Bt農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸，更深入地了解Bt對鱗翅目

2、昆蟲的作用機(jī)理，對于研究Bt合理使用、制定延緩昆蟲抗性發(fā)展的策略具有重要意義。 本研究以BtHTX—42（Cry1Ac）為研究菌株，利用液體雙相分離法初步提取毒素晶體蛋白，采用等電點(diǎn)沉淀法進(jìn)行純化，然后將所得毒素蛋白溶解，最后經(jīng)凝膠過濾層析，收集280nm紫外吸收峰蛋白樣品，SDS—PAGE分析得到高純度、高濃度的BtCry1Ac毒素。 本研究以四齡棉鈴蟲幼蟲為供試?yán)ハx，通過差速離心法，成功分離到棉鈴蟲幼蟲中腸刷狀緣膜囊

3、（BBMV），采用Bradford法分別對其提取后的組織碎片、離心上清液、離心沉淀中的蛋白含量進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)大部分蛋白質(zhì)都存在于提取的中腸BBMV離心沉淀中。 利用生物素標(biāo)記BtCry1Ac毒素活化片段，進(jìn)行體外競爭結(jié)合印跡分析，在大約60kDa處明顯有一條單一的蛋白條帶，增加未經(jīng)生物素標(biāo)記的Cry1Ac毒素含量，蛋白條帶呈現(xiàn)減弱趨勢，毒素與BBMV的結(jié)合相對量也不斷降低，當(dāng)未經(jīng)生物素標(biāo)記的Cry1Ac毒素含量增加為初始濃度的1

4、00倍時(shí)，毒素與BBMV的結(jié)合相對量由開始的100％下降為20％，相對降低了約80％。表明Cry1Ac毒素相互之間能夠發(fā)生同源競爭結(jié)合，制備的Cry1Ac毒素和棉鈴蟲中腸BBMV能夠用于后續(xù)試驗(yàn)，具有較高的生理活性。 采用SDS—PAGE和免疫共沉淀技術(shù)研究表明，Cry1Ac毒素對棉鈴蟲中腸BBMV總蛋白量和棉鈴蟲中腸受體蛋白都產(chǎn)生明顯影響。與未飼喂毒素棉鈴蟲相比較，毒素作用后的棉鈴蟲中腸小分子量蛋白條帶出現(xiàn)丟失，尤其是在蛋白表

5、達(dá)量上表現(xiàn)出較大差異，特別是成功分離到一種120kDa的蛋白，經(jīng)過質(zhì)譜分析鑒定為氨肽酶APN，并且中腸受體蛋白氨肽酶APN表達(dá)量也明顯增加。 采用Westernblot技術(shù)研究Cry1Ac毒素寡聚體形成能力，結(jié)果表明Cry1Ac毒素在棉鈴蟲中腸BBMV中能夠形成二聚體和四聚體，經(jīng)過100℃高溫處理后毒素寡聚體完全解離為毒素單體。 研究Cry1Ac毒素作用前后對棉鈴蟲幼蟲病理學(xué)的影響發(fā)現(xiàn)，與正常棉鈴蟲幼蟲相比，飼喂毒素的棉