甜菜夜蛾和棉鈴蟲對Cry1Ca和Cry1Ac敏感性差異的機理研究.pdf

1、轉蘇云金桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）晶體毒素(cry toxin)基因的棉花品種在我國已大面積種植多年。其應用有效控制了靶標害蟲——棉鈴蟲和棉紅鈴蟲的為害，提高了棉花的產(chǎn)量、質(zhì)量以及棉農(nóng)的收入，減輕了環(huán)境污染，防止了農(nóng)藥中毒。但是，隨著轉基因棉花的廣泛種植，棉田的次要害蟲如甜菜夜蛾(Spodoptera exigua Hubner)等上升為主要害蟲。原因之一是轉入棉花品種的Cry毒素基因大都由Cry1Ac基

2、因改造而來，其產(chǎn)物對甜菜夜蛾幼蟲毒力較差。國外的研究結果表明，Cry1Ab、Cry1Ba和Cry1Ca對甜菜夜蛾的毒力均顯著高于Cry1Ac，尤其Cry1Ca對甜菜夜蛾的毒力最強，是理想的替代毒素。
　　 昆蟲對Cry毒素的耐受性由多種原因決定。前毒素的溶解、酶解活化及失活、毒素穿過圍食膜與受體的結合、寡聚體形成及插入細胞膜、空洞的形成和腸道微生物的影響等過程都可能與耐受性相關。因此，我們比較研究了甜菜夜蛾和棉鈴蟲受體蛋白、中腸

3、蛋白酶及腸道微生物與Cry1Ac和Cry1Ca的互作，試圖揭示兩種害蟲對不同晶體蛋白敏感性差異的機制。
　　 1.甜菜夜蛾和棉鈴蟲鈣粘蛋白與Cry1Ca和Cry1Ac的互作
　　 克隆了甜菜夜蛾鈣粘蛋白基因全長，命名為SeCad2，其氨基酸序列與棉鈴蟲的同源性高達59‰且存在三個與之相應的保守的毒素結合位點。體外表達了甜菜夜蛾和棉鈴蟲包含三個毒素結合位點的鈣粘蛋白肽段，蛋白印跡、點雜交和增效實驗都證明，鈣粘蛋白肽段與Cr

4、y1Ca和Cry1Ac的結合能力具有偏好性，且差異顯著。其中甜菜夜蛾的鈣粘蛋白肽段偏好與Cry1Ca結合，而棉鈴蟲鈣粘蛋白肽段偏好與Cry1Ac結合，與我們測定的兩種Bt對其敏感性差異是一致的。據(jù)此我們認為，鈣粘蛋白與晶體毒素的互作與害蟲的敏感性差異相關。
　　 2.甜菜夜蛾堿性磷酸酶的分子克隆與特性分析
　　 克隆了甜菜夜蛾Bt次級受體堿性磷酸酶ALP1基因，發(fā)現(xiàn)ALP1在幼蟲中腸組織中表達量最高。比較了原核表達的Se

5、ALP1與Cry1Ca和Cry1Ac的結合能力差異，發(fā)現(xiàn)SeALP1偏好與Cry1 Ca結合。
　　 3.中腸蛋白酶對Cry毒素活性的影響
　　 通過甜菜夜蛾和棉鈴蟲中腸酶液對Cry1Ca和Cry1Ac的消化比較發(fā)現(xiàn)，兩種害蟲中腸酶液對其消化能力沒有明顯差異。但是昆蟲中腸液能對活化毒素過度消化，造成殘存完整的有活性的Bt減少，適量的蛋白酶抑制劑與活化毒素共同飼喂昆蟲可以抑制活化毒素的過度水解，對Bt活化毒素毒力有一定的增

6、效作用。
　　 4.青霉素影響甜菜夜蛾幼蟲耐受幾種蘇云金桿菌晶體蛋白的能力
　　 評估了Cry1Ab、Cry1Ba和Cry1Ca蛋白對甜菜夜蛾2齡幼蟲的毒力，LC50值分別為0.4425、0.6757和0.1502μg/cm2，Cry1Ba毒力最低，其次是Cry1Ab，而Cry1Ca毒力最高。青霉素影響幼蟲對晶體毒素的耐受能力。一次添加高劑量(500μg/cm2)青霉素于飼料中顯著提高幼蟲的耐受能力，以含低劑量(60μg