棉鈴蟲(chóng)中腸Cry1A結(jié)合蛋白分離、鑒定及其與抗性的關(guān)系.pdf

1、轉(zhuǎn)基因棉花的大規(guī)模種植對(duì)控制棉花害蟲(chóng)的危害發(fā)揮了重要作用，但害蟲(chóng)長(zhǎng)期處于轉(zhuǎn)基因作物Bt毒蛋白的高壓選擇下，害蟲(chóng)對(duì)Bt作物抗性問(wèn)題將不容忽視。昆蟲(chóng)對(duì)Bt毒素的抗性機(jī)制是復(fù)雜和多樣的，但中腸結(jié)合位點(diǎn)的改變是最主要的一種機(jī)制。棉鈴蟲(chóng)中已知的受體有氨肽酶N和鈣粘蛋白。保存在本實(shí)驗(yàn)室的高抗Cry1A蛋白的棉鈴蟲(chóng)品系經(jīng)前人研究未發(fā)現(xiàn)該品系存在鈣粘蛋白基因的缺失、失活，比較抗、感品系棉鈴蟲(chóng)的鈣粘蛋白、APN序列，只發(fā)現(xiàn)少量氨基酸的變異，因此該棉鈴蟲(chóng)品

2、系對(duì)Cry1A產(chǎn)生抗性很可能與受體蛋白表達(dá)水平變化相關(guān)或存在其它的受體蛋白。 本文首先比較了兩種雙向電泳系統(tǒng)以及幾種BBMV提取方法對(duì)雙向電泳的影響，建立了棉鈴蟲(chóng)中腸Bt結(jié)合蛋白蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法，利用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法分離和分析了棉鈴蟲(chóng)中腸Cry1A毒素的結(jié)合蛋白，比較了抗、感品系棉鈴蟲(chóng)中Cry1Ac結(jié)合蛋白的變化，探討該棉鈴蟲(chóng)品系對(duì)Bt毒蛋白產(chǎn)生抗性的可能機(jī)制。并比較了抗、感品系棉鈴蟲(chóng)中與不同Bt毒蛋白作用的結(jié)合蛋白的差異。

3、在國(guó)內(nèi)首次開(kāi)展了利用蛋白質(zhì)組學(xué)研究棉鈴蟲(chóng)的中腸Bt結(jié)合蛋白及其與抗性的關(guān)系。主要結(jié)果如下： 1、方法的建立：比較ISO-DALT和IPG-DALT兩種雙向電泳系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)這兩種系統(tǒng)都可以用于棉鈴蟲(chóng)Cry1Ac結(jié)合蛋白的分離，ISO-DALT對(duì)結(jié)合蛋白的分離效果雖比IPG-DALT更好，尤其對(duì)高分子量蛋白的分離明顯優(yōu)于IPG-DALT法，但由于上樣量少，因此對(duì)后續(xù)的質(zhì)譜分析非常不利；IPG-DALT雖較昂貴但有利于進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，因此

4、本文選用IPG-DALT系統(tǒng)進(jìn)行雙向電泳。比較已報(bào)道的這三種BBMV提取方法：Wolfersberger法、English-Readdy法、Abdul-Rauf法，結(jié)果顯示這三種方法對(duì)分離Cry1Ac結(jié)合蛋白的種類(lèi)沒(méi)有影響，但這三種方法獲得的蛋白量不一樣結(jié)果?？偨Y(jié)三種方法的優(yōu)點(diǎn)，建立了一種新的綜合BBMV提取方法，獲得了高量的蛋白，通過(guò)雙向電泳和結(jié)合試驗(yàn)證明該方法適合雙向電泳Cry1A結(jié)合蛋白研究。 2、利用雙向電泳結(jié)合West

5、ern雜交以及生物質(zhì)譜的方法，研究了棉鈴蟲(chóng)中腸Cry1Ac結(jié)合蛋白，首次鑒定得到棉鈴蟲(chóng)中腸四種新的Cry1Ac結(jié)合蛋白：V-ATPase亞基B、熱激蛋白、肌動(dòng)蛋白以及一種未知的新蛋白。肌動(dòng)蛋白和V-ATPase亞基A己報(bào)道為煙芽夜蛾中Cry1Ac結(jié)合蛋白，熱激蛋白和未知新蛋白為首次報(bào)道的昆蟲(chóng)中腸Cry1Ac結(jié)合蛋白。 3、用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法比較了抗、感棉鈴蟲(chóng)中腸結(jié)合蛋白的數(shù)量和表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)結(jié)合蛋白種類(lèi)無(wú)差異，但其中一種新的結(jié)

6、合蛋白在抗性品系中表達(dá)量至少下降了6.49倍。前人的研究說(shuō)明，碘標(biāo)記結(jié)合試驗(yàn)證明結(jié)合位點(diǎn)或受體數(shù)目減少是該抗性品系對(duì)Cry1A毒蛋白產(chǎn)生抗性的主要原因。結(jié)合前人研究和本文結(jié)果，本文新結(jié)合蛋白表達(dá)量嚴(yán)重降低可能是該抗性品系產(chǎn)生抗性的原因之一。 4、初步比較Cry1Ac、Cry1Ab和Cry1Ah作用于敏感品系和抗性品系的結(jié)合蛋白。結(jié)果發(fā)現(xiàn)無(wú)論是抗性品系和敏感品系Cry1Ab的結(jié)合都是最少的，在敏感品系中，Cry1Ab未結(jié)合肌動(dòng)蛋白