美國白蛾中腸HcAPN1的鑒定及其與Bt Cry蛋白的結(jié)合分析.pdf

1、美國白蛾（Hyphantria cunea（Drury））屬鱗翅目燈蛾科，是世界性檢疫害蟲，對我國林業(yè)和園林綠化造成重大危害。蘇云金桿菌（Bacillus thuringiensis，簡稱Bt）是美國白蛾生防農(nóng)藥之一，其主要殺蟲活性物質(zhì)殺蟲晶體蛋白通過與中腸受體蛋白結(jié)合發(fā)揮毒性作用。氫肽酶N（aminopeptidase N，APN）是存在于昆蟲中腸Bt最重要的受體蛋白之一。為了明確Bt毒蛋白在美國白蛾中腸的特異受體，本試驗分別克隆表達

2、了Bt殺蟲蛋白基因及美國白蛾中腸APN1基因，以期明確兩者間的互作機制。
　　主要結(jié)果如下:
　　1.明確了Bt CYZ-4菌株對美國白蛾2齡幼蟲的致死及亞致死效應(yīng)
　　室內(nèi)試驗測定了Bt菌株CYZ-4對美國白蛾2齡幼蟲的致死、亞致死效應(yīng)。其96hLC50為2.57×105孢子/mL，濃度＞106孢子/mL處理組美國白蛾均未能化蛹，而＜106孢子/mL處理組存活下來幼蟲均能化蛹并羽化，且幼蟲發(fā)育歷期隨Bt濃度的增加而延

3、長;亞致死濃度Bt處理美國白蛾96h平均校正死亡率均低于20％，幼蟲期略有延遲;蛹重均顯著高于對照。
　　2.從Bt CYZ-4菌株中克隆，表達cry2Ab33，并制備特異抗體
　　經(jīng)RFLP-PCR檢測，該菌株存在cry2Ab基因，設(shè)計cry2Ab全長引物，擴增得到1902bp全長基因序列。GenBank登錄號KP053646，被國際Btδ-內(nèi)毒素基因命名委員會命名為cry2Ab33。cry2Ab33基因編碼634個氨基酸

4、，預(yù)測蛋白分子量和等電點分別為70.67kDa和8.36。構(gòu)建重組表達載體pET30a-2Ab33，轉(zhuǎn)化E.coli BL21，得到高效表達菌株EC2Ab33，純化蛋白并制備Cry2Ab33的特異抗體。
　　3.成功克隆和表達了美國白蛾中腸apn1基因
　　分離美國白蛾中腸，提取中腸RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA模板，通過PCR，RACE獲得基因片段，用DNAMAN進行序列拼接及NCBI中BLAST相似性比對為APN1類，所獲得

5、的編碼美國白蛾氨肽酶N全長基因hcapn1，GenBank登錄號為KP053647，基因全長3181bp，開放閱讀框為3000bp，編碼1000個氨基酸，預(yù)測蛋白分子量和等電點分別為113.14kDa和4.85;設(shè)計去信號肽引物SF&SR，PCR擴增獲得hcapn1，構(gòu)建原核重組表達載體pET30a-hcapn1，誘導(dǎo)后表達了約110kDa HcAPN1重組蛋白。
　　4.美國白蛾中腸APN1蛋白與三種Cry毒蛋白的Ligand

6、blot分析
　　將Cry2Ab33，Cry1 Ac，Cry9Ea6原毒素經(jīng)Trypsin消化為有活性的蛋白，將大腸桿菌表達的HcAPN1重組蛋白進行SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)膜至PVDF，與活性蛋白分別進行體外Ligand blot雜交試驗，顯示HcAPN1重組蛋白可以與Cry9Ea6結(jié)合，而不與Cry2Ab33及Cry1Ac發(fā)生特異結(jié)合，推測HcAPN1可能為Cry9Ea6中腸受體蛋白，不是Cry2Ab33，Cry1Ac的特異受體

7、。
　　5.明確HcAPN1與Cry9Ea6的結(jié)合區(qū)
　　為進一步確定HcAPN1蛋白與Cry9Ea6毒蛋白的結(jié)合區(qū)，設(shè)計兩對結(jié)構(gòu)域引物F1&R1和F2&R2?？寺〔⒈磉_蛋白分子量為62kDa，48kDa的HcAPN1G和HcAPN1E，其編碼的結(jié)構(gòu)域蛋白分別位于34 Asp～Asp527和563Leu～Gln925之間，體外結(jié)合試驗顯示只有HcAPN1E與Cry9Ea6結(jié)合，說明Cry9Ea6與HcAPN1的結(jié)合發(fā)生在Hc