Bt殺蟲基因cry7、cry8的鑒定及表達.pdf

1、蘇云金芽胞桿菌，為芽胞桿菌屬，是在世界范圍內(nèi)廣泛分布的一種革蘭氏陽性菌，作為一種環(huán)保型的殺蟲劑被廣泛用于害蟲的防治，其產(chǎn)生的蛋白可以對多種害蟲有高效的殺蟲活性。蘇云金芽胞桿菌被認為是化學農(nóng)藥的一個有效的替代品。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，蘇云金芽胞桿菌也成為轉(zhuǎn)基因作物抗蟲基因的主要來源。因此，尋找新的殺蟲活性基因?qū)οx的防治具有重要意義。由于鞘翅目葉甲科害蟲的危害日益嚴重，因此篩選出對其有高活性的菌株和基因具有重要意義。
　　本研究的主

2、要內(nèi)容如下:(1)本研究從海南地區(qū)的土壤中分離得到423株蘇云金芽胞桿菌，利用聚合酶鏈式反應(PCR)和聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)方法鑒定其菌株的基因型和殺蟲晶體蛋白的成分。經(jīng)PCR擴增結(jié)果顯示其中23株菌中含有cry7Ab基因，片段大小為3417 bp。對含有cry7Ab基因的BJH705（GenBank登錄號為KX010669）菌株進行了進一步的蛋白表達及生物活性測定。SDS-PAGE結(jié)果顯示該菌株可以表達分子量約為13

3、0 kDa的殺蟲晶體蛋白。對大猿葉甲進行生物活性測定，復篩結(jié)果顯示，該蛋白對大猿葉甲有較高的殺蟲活性其LC50為53.386μg/mL。(2)對實驗室保存的菌株3-1-a進行基因型鑒定，發(fā)現(xiàn)其中含有cry8基因，進一步用全長引物進行擴增，測序結(jié)果顯示該菌株同時含有cry8Ax和cry8Ea基因。與pEB表達載體連接，并在大腸桿菌BL21中表達，SDS-PAGE結(jié)果顯示，cry8Ax和cry8Ea基因可以在大腸桿菌中分別表達分子量為80

4、kDa、130 kDa的殺蟲蛋白。序列已提交GenBank注冊，登錄號分別為KU986725，KU955850。以大猿葉甲二齡幼蟲為供試昆蟲對兩種蛋白進行生物活性初步測定，校正死亡率分別為56.89％，77.87％，利用80 kDa的蛋白進行復篩，其LC50值為83.329μg/mL。
　　本研究針對我國海南地區(qū)和實驗室保存菌株開展了菌株篩選與殺蟲基因克隆的研究，獲得有效新菌株BJH705和3-1-a，克隆有效殺蟲基因3個，研究結(jié)