小菜蛾對Bt毒素Cry1Ac抗性的生化與分子機理.pdf

1、化學(xué)農(nóng)藥的廣泛使用對農(nóng)業(yè)發(fā)展和糧食安全起了重要作用，但是由于害蟲抗藥性的發(fā)展，防治抗藥性害蟲正變得越來越困難。蘇云金芽孢桿菌Bacillus thuringiensis(Bt)由于其殺蟲晶體蛋白(ICPs)具有高度專一性，對人畜和非靶標(biāo)昆蟲非常安全而被廣泛用于防治小菜蛾等鱗翅目害蟲。小菜蛾P(guān)lutella xylostella是一種全球性分布的蔬菜害蟲，早在1990年就有田間小菜蛾種群對Bt制劑產(chǎn)生抗性的報道，但迄今為止，小菜蛾對Bt抗

2、性的分子機理還是沒有研究清楚。為了研究我國小菜蛾對CrylAc的抗性機理，首先在室內(nèi)篩選獲得一個高抗品系(SZBT)，并用F1篩選法檢測了3個小菜蛾田間種群CrylAc抗性基因的頻率；通過蛋白組學(xué)方法，對小菜蛾CryAc抗性和敏感品系幼蟲中腸毒素結(jié)合蛋白進行分離和鑒定，發(fā)現(xiàn)一種Bt毒素受體-氨肽酶N蛋白(PxAPN2)在抗性品系中表達量明顯低于敏感品系；然后，克隆了小菜蛾P(guān)xAPN2基因，并采用RNAi技術(shù)明確了PxAPN2基因在小菜蛾

3、對CrylAc抗性產(chǎn)生中的作用。明確小菜蛾對Bt毒素CrylAc抗性的生化和分子機理對于小菜蛾Bt抗性治理具有重要意義。
　　 ⑴小菜蛾CrylAc抗性遺傳互補與田間種群CrylAc抗性基因頻率檢測。由于Bt制劑的大量使用，我國小菜蛾田間種群對CrylAc已產(chǎn)生了不同程度的抗性。由于小菜蛾對CrylAc抗性為不完全隱性遺傳，檢測抗性基因頻率對于制定抗性治理措施尤為重要。通過室內(nèi)篩選獲得對CrylAc抗性達2000倍左右的SZBT

4、品系，該品系對CrvlAc的抗性表現(xiàn)為Ⅰ型(Mode1)?？剐赃z傳互補試驗表明，SZBT品系與來自美國的CrylAc-R抗性品系對CrylAc的抗性由相同遺傳位點控制。將2008年采自廣東廣州、惠州及云南玉溪的田間小菜蛾分別于SZBT進行單對雜交，通過檢測120個單對雜交后代(F1)在CrylAc區(qū)分劑量(2μg/mL)下的死亡率，測得這3個田間種群CrylAc抗性基因頻率分別為0.375、0.472和0.156。廣州、惠州和玉溪田間種

5、群對CrylAc的抗性分別為73、117和13倍，抗性程度與其抗性基因頻率相一致。
　　 ⑵小菜蛾中腸CrylAc結(jié)合蛋白的分離與鑒定。用生物素標(biāo)記的CrylAc分別與敏感品系ROTH、抗性品系SZBT和對照品系SZ小菜蛾4齡幼蟲中腸BBMV(用傳統(tǒng)的SDS-PAGE分離)進行配基結(jié)合試驗，發(fā)現(xiàn)CrylAc結(jié)合蛋白有10條主帶。小菜蛾SZBT抗性品系110 kDa結(jié)合蛋白表達量低于敏感品系，而其他結(jié)合蛋白表達量差異不明顯。據(jù)此推

6、測，110 kDa的CrylAc結(jié)合蛋白可能為CrylAc的功能受體，其表達量下降可能與SZBT品系對CrylAc抗性相關(guān)。為了進一步分離和鑒定CrylAc結(jié)合蛋白，用2-D電泳和配基結(jié)合方法對小菜蛾抗性品系(SZBT)和敏感品系(ROTH)中腸BBMV中CrylAc結(jié)合蛋白進行分離，并通過肽質(zhì)量指紋圖譜(peptide mass fingerprinting，PMF)對主要結(jié)合蛋白進行鑒定。鑒定的小菜蛾CrylAc結(jié)合蛋白包括氨肽酶N

7、(PxAPN2)、儲存蛋白(storage protein)、肌動蛋白(actin)、硫酸酯酶(glucosinolate sulfatase)、V-ATPase亞基B(vacuolar ATPaseB subunit)等。小菜蛾SZBT抗性品系中PxAPN2表達量明顯低于敏感品系的相應(yīng)結(jié)合蛋白，該PxAPN2(分子量為110 kDa)可能即為1-D電泳所發(fā)現(xiàn)的在抗性品系中表達量降低的110 kDa結(jié)合蛋白。氨肽酶N是鱗翅目昆蟲中腸BB

8、MV上CrylAc毒素的重要受體，小菜蛾P(guān)xAPN2蛋白的表達量降低可能與抗性品系CrylAc抗性相關(guān)。
　　 ⑶小菜蛾P(guān)xAPN2基因沉默后對CrylAc敏感性的影響。采用RT-PCR技術(shù)分別克隆了抗性(SZBT)和敏感(ROTH)品系中編碼110kDaCrylAc結(jié)合蛋白的氨肽酶N基因(PxAPN2)?？剐院兔舾衅废礟xAPN2基因間有多個位點的氨基酸發(fā)生替換。用實時定量PCR比較PxAPN2基因在小菜蛾SZBT和ROTH品

9、系四齡幼蟲中腸中的mRNA表達量，發(fā)現(xiàn)SZBT抗性品系PxAPN2 mRNA表達量下降為ROTH敏感品系的33.9％。為了證明小菜蛾P(guān)xAPN2在CryAc抗性形成中的作用，采用RNAi技術(shù)使PxAPN2基因mRNA表達下調(diào)，研究PxAPN2下調(diào)能否使小菜蛾敏感品系對CrylAc獲得抗性。通過喂食體外合成的PxAPN2 dsRNA干擾小菜蛾ROTH敏感品系PxAPN2基因的表達，結(jié)果表明喂食PxAPN2 dsRNA最高可以使PxAPN2

10、基因mRNA表達量下降53％，而另一種氨肽酶N基因(APNA)mRNA表達量則沒有明顯變化。小菜蛾P(guān)xAPN2基因被沉默后使ROTH敏感品系幼蟲對CrylAc產(chǎn)生4-14倍抗性。上述結(jié)果表明，小菜蛾P(guān)xAPN2是CrylAc的功能受體，其表達量降低導(dǎo)致小菜蛾對CryAc產(chǎn)生抗性。本研究運用蛋白組學(xué)、配基結(jié)合、基因克隆和基因沉默等技術(shù)，系統(tǒng)研究了小菜蛾對Bt毒素CrylAc抗性的生化和分子機理，證明了PxAPN2為小菜蛾幼蟲中腸中Cryl