小菜蛾對(duì)阿維菌素抗性機(jī)理的研究.pdf

1、本研究以阿維菌素抗性、敏感小菜蛾為研究對(duì)象，從生化、靶標(biāo)分子和細(xì)胞膜三方面對(duì)小菜蛾對(duì)阿維菌素的抗性機(jī)理進(jìn)行了研究。具體結(jié)果如下： 1．以阿維菌素對(duì)小菜蛾進(jìn)行選育，獲得抗性品系。生測(cè)結(jié)果表明，阿維菌素敏感品系(XH-S)對(duì)阿維菌素的敏感度是阿維菌素抗性品系(AV-R)的1078倍，而對(duì)伊維菌素和甲胺基阿維菌素的交互抗性也達(dá)1000多倍，交互抗性測(cè)定表明說(shuō)明該品系確實(shí)為對(duì)阿維菌素類(lèi)殺蟲(chóng)藥劑敏感的品系。對(duì)其它藥劑的生測(cè)結(jié)果表明，AV-

2、R對(duì)菊酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑有一定的交互抗性，XH-S對(duì)高效氯氰菊酯、氰戊菊酯敏感度分別是抗性的12.4和12.6倍。而XH-S對(duì)氟氯氰菊酯、溴氰菊酯、聯(lián)苯菊酯、醚菊酯的敏感度分別是抗性的5.2、4.1、7.9和8.9倍。對(duì)硫丹、林丹、氟蟲(chóng)腈、茚蟲(chóng)威及多殺菌素交互抗性很低。 2．對(duì)阿維菌素敏感(XH-S)與抗性小菜蛾(AV-R)體內(nèi)的解毒酶(羧酸酯酶、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶)及靶標(biāo)酶乙酰膽堿酯酶的測(cè)定結(jié)果表明，兩品系靶標(biāo)酶乙酰膽堿酯酶的比活力沒(méi)

3、有明顯差異。敏感品系和抗性品系的解毒酶羧酸酯酶、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的比活力也沒(méi)有明顯差異。利用酶標(biāo)儀測(cè)定抗性與敏感品系單頭小菜蛾羧酸酯酶的活性測(cè)，統(tǒng)計(jì)不同活性段內(nèi)的小菜蛾個(gè)體分布頻率，結(jié)果表明兩品系個(gè)體羧酸酯酶活力分布頻率相同。 3．通過(guò)比較已發(fā)表的5種昆蟲(chóng)GABA受體基因的序列，設(shè)計(jì)了兩對(duì)簡(jiǎn)并引物，應(yīng)用巢式RT-PCR技術(shù)克隆獲得了1069bp的小菜蛾P(guān)lutella xylostella (Linnaeus) GABA受體基

4、因的cDNA片段，編碼355個(gè)氨基酸。序列分析表明，該片段包含昆蟲(chóng)GABA受體基因中保守的半胱氨酸橋和3個(gè)疏水跨膜區(qū)，與煙芽夜蛾GABA受體3α亞基的同源性達(dá)96.6％，與黑腹果蠅等其它6種昆蟲(chóng)GABA受體的氨基酸序列的同源性是80.9～86.8％。用DNAMAN軟件對(duì)其核苷酸序列分析表明，該片段與已知的兒種昆蟲(chóng)GABA受體的堿基序列具有62％以上的同源性；同時(shí)對(duì)推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行疏水性分析，表明此序列包含3個(gè)明顯的疏水區(qū)，且編碼這3

5、個(gè)疏水區(qū)的氨基酸分別與其它昆蟲(chóng)中GABA受體的M<,1>、M<,2>和M<,3> 3個(gè)跨膜區(qū)的氨基酸完全相同。 4．對(duì)抗性和敏感晶系的GABA受體基因片段序列比較發(fā)現(xiàn)，抗性和敏感品系有98.97％的堿基相同，在六個(gè)位點(diǎn)的堿基存在差異，第201位敏感品系為T(mén)，而抗性品系為G；第204位敏感品系為C，而抗性品系為T(mén)；第752位敏感品系為G，抗性品系為A；第672位敏感品系為C，抗性品系為T(mén)；第1062敏感品系為C，抗性晶系為A；第1

6、065位敏感品系為C，抗性品系為G。由核苷酸推導(dǎo)的氨基酸比較發(fā)現(xiàn)，在第752位核苷酸中，發(fā)生的由G到A的突變導(dǎo)致第187位氨基酸由精氨酸(A唱)變?yōu)橘嚢彼?Lys)，這一突變位點(diǎn)位丁M<,3>和M<,4>之間。根據(jù)克隆測(cè)序的阿維菌素抗性、敏感小菜蛾GABA受體序列，依據(jù)等位基因特異性擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)一條正向引物，西條反向引物，以阿維菌素敏感、抗性晶系小菜蛾DNA作模板，分別用正常、突變引物擴(kuò)增；用正常引物擴(kuò)增，阿維菌素抗性、敏感品

7、系在300bp左右位置得到擴(kuò)增產(chǎn)物；而用突變引物為引物時(shí)，阿維菌素抗性品系在預(yù)計(jì)的位置未得到條帶。說(shuō)明此突變可能為測(cè)序錯(cuò)誤，與抗性無(wú)關(guān)。 5．不同種類(lèi)的殺蟲(chóng)劑對(duì)小菜蛾線粒體膜流動(dòng)性的影響不同。在濃度1×10<'-4> mol/L時(shí)，阿維菌素類(lèi)殺蟲(chóng)劑對(duì)線粒體膜流動(dòng)性的影響最大，而高效氯氰菊酯和溴氰菊酯等擬除蟲(chóng)菊酯僅次于阿維菌素類(lèi)，這些藥劑均明顯降低膜的流動(dòng)性。而有機(jī)氯殺蟲(chóng)劑硫丹則增加線粒體膜的流動(dòng)性。乙酰甲胺磷、辛硫磷及氟蟲(chóng)腈等對(duì)

8、線粒體膜的流動(dòng)性影響很小。測(cè)定不同藥劑在不同溫度下對(duì)膜的流動(dòng)性的影響。結(jié)果表明，隨著溫度的升高，偏振度變小，膜的流動(dòng)性增加，甲胺磷在不同溫度下對(duì)膜的流動(dòng)性影響比較小。而阿維菌素、依維菌素、甲維鹽及高效氯氰菊酯對(duì)膜流動(dòng)性的作用受溫度影響較大。硫丹和氟蟲(chóng)腈在不同溫度下對(duì)線粒體膜的影響基本相同，不因溫度的改變而有太大的變化。利用熒光偏振法分別測(cè)定了不同溫度下，阿維菌素敏感與抗性小菜蛾線粒體膜的流動(dòng)性。低于25℃時(shí)，敏感與抗性小菜蛾膜的流動(dòng)性明