棉鈴蟲(chóng)江浦和安陽(yáng)種群對(duì)CrylAc和Cry2Ab抗性基因頻率及抗性遺傳方式.pdf

1、表達(dá)蘇云金桿菌殺蟲(chóng)晶體蛋白的轉(zhuǎn)基因Bt作物在全球范圍推廣種植，有效控制了重要作物上靶標(biāo)害蟲(chóng)的為害，同時(shí)減少了化學(xué)殺蟲(chóng)劑的使用。Bt棉花自1997年開(kāi)始在我國(guó)種植，目前Bt棉花種植面積已經(jīng)占我國(guó)棉花總種植面積70％左右，Bt棉花的大范圍推廣，有效地抑制了棉花及其他寄主作物上棉鈴蟲(chóng)的種群密度。鑒于在其他國(guó)家已經(jīng)有田間害蟲(chóng)對(duì)Bt作物產(chǎn)生抗性進(jìn)化的先例及在我國(guó)北方棉區(qū)部分田間種群對(duì)Cry1Ac敏感性下降的報(bào)道，棉鈴蟲(chóng)對(duì)Bt棉花的抗性進(jìn)化一直是B

2、t棉花持續(xù)應(yīng)用的最大威脅。
　　 目前，主要依據(jù)對(duì)害蟲(chóng)室內(nèi)Bt抗性品系的研究結(jié)果來(lái)制定相應(yīng)的抗性檢測(cè)方法和治理措施，高劑量/庇護(hù)所和基因疊加是現(xiàn)行的兩種主要抗性治理策略。靶標(biāo)害蟲(chóng)自然種群Bt抗性的進(jìn)化過(guò)程比室內(nèi)篩選品系復(fù)雜，因此，基于對(duì)田間種群抗性基因的檢測(cè)鑒定及其抗性遺傳方式的研究對(duì)建立更加合理的抗性監(jiān)測(cè)和治理策略具有重要意義。為此，通過(guò)F1檢測(cè)技術(shù)對(duì)來(lái)自長(zhǎng)江流域和黃河流域的兩個(gè)棉鈴蟲(chóng)田間種群進(jìn)行了抗性基因檢測(cè)，鑒定到大量與室

3、內(nèi)抗性品系不同的抗性基因，發(fā)現(xiàn)了田間種群鈣粘蛋白抗性等位基因的多樣性。通過(guò)建立不同的田間抗性等位基因純合品系進(jìn)行抗性遺傳互補(bǔ)研究，發(fā)現(xiàn)田間種群至少存在2種不同的抗性機(jī)制。Cry2Ab是基因疊加轉(zhuǎn)基因棉花的一種重要候選基因，通過(guò)對(duì)河南安陽(yáng)棉鈴蟲(chóng)田間種群室內(nèi)篩選獲得了Cry2Ab抗性品系，并對(duì)其抗性風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行了評(píng)估。本文的研究結(jié)果對(duì)于我國(guó)棉鈴蟲(chóng)對(duì)Bt棉花抗性的監(jiān)測(cè)和治理具有重要指導(dǎo)意義。
　　 1.棉鈴蟲(chóng)江蘇江浦種群鈣粘蛋白基因突變的

4、多樣性
　　 通過(guò)F1檢測(cè)對(duì)2008年江蘇江浦棉鈴蟲(chóng)田間種群進(jìn)行了與Cry1Ac抗性相關(guān)的鈣粘蛋白突變基因頻率估算及鑒定。在本試驗(yàn)中，成功檢測(cè)了123個(gè)采集自江蘇江浦的田間棉鈴蟲(chóng)與室內(nèi)抗性品系SCD-r1（r1純合子）雜交單對(duì)系的F1后代。在六個(gè)候選單對(duì)系中，共鑒定到5種不同的鈣粘蛋白（Ha_BtR）突變等位基因（r4-r8）。在5個(gè)抗性基因中，由于在基因組DNA中發(fā)生堿基替換或插入突變而導(dǎo)致基因發(fā)生突變。在另外兩個(gè)候選單對(duì)系中

5、，檢測(cè)到完整的鈣粘蛋白等位基因，推測(cè)在兩個(gè)單對(duì)系的田間親本個(gè)體上，可能攜帶由于氨基酸點(diǎn)突變而導(dǎo)致鈣粘蛋白受體功能喪失的抗性基因，或者攜帶其它位點(diǎn)的抗性基因。通過(guò)計(jì)算，2008年江蘇江浦種群鈣粘蛋白突變基因頻率為0.024(0.010-0.055)。結(jié)合之前在棉鈴蟲(chóng)中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)3個(gè)鈣粘蛋白突變等位基因（r1、r2和r3）與Cry1Ac抗性相關(guān)，目前已經(jīng)在我國(guó)3個(gè)棉鈴蟲(chóng)田間種群中發(fā)現(xiàn)8個(gè)不同的鈣粘蛋白突變基因，田間突變基因的多樣性將嚴(yán)重影響D

6、NA分子檢測(cè)技術(shù)的有效性，F(xiàn)1檢測(cè)技術(shù)用于棉鈴蟲(chóng)田間種群的抗性基因檢測(cè)將更加切實(shí)有效。
　　 2.棉鈴蟲(chóng)河南安陽(yáng)種群抗性基因頻率檢測(cè)及鈣粘蛋白基因突變鑒定
　　 通過(guò)F1檢測(cè)對(duì)2009年河南安陽(yáng)棉鈴蟲(chóng)田間種群進(jìn)行了與Cry1Ac抗性相關(guān)基因的頻率估算及鑒定。在成功檢測(cè)到的215個(gè)單對(duì)系中，發(fā)現(xiàn)34個(gè)候選單對(duì)的田間個(gè)體可能攜帶抗性基因，該地區(qū)田間棉鈴蟲(chóng)種群對(duì)Cry1Ac的抗性基因頻率為0.091(0.066-0.123)。

7、在候選的陽(yáng)性單對(duì)中，鑒定到胞內(nèi)區(qū)缺失突變與可變剪接兩種新型的鈣粘蛋白突變基因，進(jìn)一步豐富了田間鈣粘蛋白基因突變的多樣性。同時(shí)檢測(cè)到大量正常翻譯的鈣粘蛋白等位基因，這些基因可能存在氨基酸替換引起的抗性突變。
　　 通過(guò)檢測(cè)陽(yáng)性單對(duì)系F1存活幼蟲(chóng)與室內(nèi)敏感品系雜交后代，進(jìn)行田間抗性基因顯隱性鑒定，發(fā)現(xiàn)86％的田間個(gè)體攜帶隱性抗性基因，其余14％的個(gè)體攜帶非隱性抗性基因。盡管在田間種群中檢測(cè)到大量個(gè)體攜帶隱性抗性基因，但通過(guò)間接和直接

8、法預(yù)測(cè)田間存活個(gè)體的基因型，發(fā)現(xiàn)至少攜帶一個(gè)非隱性抗性基因的個(gè)體分別占80％和49％。在田間種群的抗性進(jìn)化中，非隱性抗性基因在決定田間抗性個(gè)體頻率中的貢獻(xiàn)高于隱性抗性基因，因此研究和開(kāi)發(fā)針對(duì)非隱性抗性基因的監(jiān)測(cè)技術(shù)和抗性治理策略將更加重要和迫切。
　　 3.F1篩選獲取的棉鈴蟲(chóng)Cry1Ac抗性等位基因的遺傳方式及遺傳互補(bǔ)
　　 建立了5個(gè)不同的田間抗性等位基因純合品系Jp14，An1，An29，An357，An156并進(jìn)

9、行了抗性分析。生物測(cè)定顯示，與敏感品系SCD相比，5個(gè)抗性品系對(duì)Cry1Ac活化毒素分別具有128，215，41，881，121倍的抗性，對(duì)Cry2Ab毒素?zé)o交互抗性。通過(guò)與敏感品系的正反交和回交分析表明，Jp14為不完全隱性抗性，An1，An29，An357，An156為不完全顯性抗性，5個(gè)品系均為常染色體，單基因遺傳。通過(guò)與室內(nèi)抗性品系SCD-r1雜交進(jìn)行遺傳互補(bǔ)分析發(fā)現(xiàn)，Jp14，An1，An29，An357品系中的抗性基因和SC

10、D-r1品系的抗性基因均存在遺傳互補(bǔ)作用，進(jìn)一步驗(yàn)證了F1檢測(cè)技術(shù)的有效性。An156品系可能為其它位點(diǎn)導(dǎo)致的不完全顯性抗性。本研究表明:(1)F1篩選可以同時(shí)檢測(cè)到隱性抗性等位基因和非隱性抗性等位基因;(2)棉鈴蟲(chóng)鈣粘蛋白抗性基因突變的多樣性可以導(dǎo)致抗性水平和抗性遺傳方式的多樣性;(3)在選用抗性監(jiān)測(cè)方法和設(shè)計(jì)抗性治理策略時(shí)，應(yīng)充分考慮到棉鈴蟲(chóng)田間種群中存在的非隱性抗性等位基因。
　　 4.棉鈴蟲(chóng)Cry2Ab抗性品系的交互抗性

11、及抗性遺傳方式
　　 通過(guò)對(duì)2009年采自河南安陽(yáng)的棉鈴蟲(chóng)田間種群在室內(nèi)用Cry2Ab4毒素進(jìn)行連續(xù)篩選，獲得了對(duì)Cry2Ab4具有高水平抗性的An2Ab品系。An2Ab抗性品系在篩選至第11代時(shí)與起始種群An相比，對(duì)Cry2Ab4具有262倍的抗性，同時(shí)對(duì)Cry1Ac活化毒素具有37倍的交互抗性。抗性遺傳研究發(fā)現(xiàn)，在第11代時(shí)，An2Ab品系對(duì)Cry2Ab和Cry1Ac毒素同為不完全顯性、常染色體遺傳，對(duì)兩種毒素的抗性都為多基