使用易錯(cuò)PCR方法對(duì)蘇云金芽胞桿菌cry1Ac基因進(jìn)行突變及其功能研究.pdf

1、蘇云金芽胞桿菌(簡(jiǎn)稱Bt)是世界上應(yīng)用范圍最廣的殺蟲(chóng)微生物,其殺蟲(chóng)活性主要來(lái)源于芽胞形成過(guò)程中產(chǎn)生的殺蟲(chóng)蛋白,對(duì)研究殺蟲(chóng)蛋白結(jié)構(gòu)和功能方面的研究是當(dāng)前的一個(gè)比較熱門的話題。蘇云金芽胞桿菌表達(dá)的CrylAc蛋白是就目前來(lái)說(shuō)是對(duì)鱗翅目昆蟲(chóng)的毒性最高,并且研究最多的Bt蛋白之一,不僅在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、森林管理上,在蚊蟲(chóng)控制及水環(huán)境生態(tài)系統(tǒng)中也具有較為廣泛的應(yīng)用,但是CrylAc蛋白結(jié)構(gòu)與功能的相關(guān)性并未完全明確,所以需要運(yùn)用基因突變技術(shù)來(lái)進(jìn)行較為深

2、入的闡釋。本論文使用易錯(cuò)PCR方法對(duì)蘇云金芽胞桿菌crylAc基因進(jìn)行突變,從突變菌株中篩選并得到了對(duì)棉鈴蟲(chóng)殺蟲(chóng)毒力提高的突變株,通過(guò)對(duì)突變前后CrylAc蛋白理化性質(zhì)的改變從而得到了蛋白結(jié)構(gòu)與功能的生物信息學(xué)證據(jù)。
　　 選擇了不同Mg2+和Mn2+濃度進(jìn)行易錯(cuò)PCR實(shí)驗(yàn),通過(guò)對(duì)突變基因的測(cè)序得到最適的PCR條件以擴(kuò)增crylAc基因。之后,將其連接至帶有Bt啟動(dòng)子和終止子的pHT315質(zhì)粒上構(gòu)建成重組質(zhì)粒pHT315ptAc

3、。將該質(zhì)粒熱擊轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Top10感受態(tài)后使用了快速裂解的方法鑒定轉(zhuǎn)化子。然后,挑取多個(gè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子接種至同一培養(yǎng)基中,提取其質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至Cry-B感受態(tài)細(xì)胞中。在對(duì)突變菌株進(jìn)行初篩、復(fù)篩等進(jìn)行各項(xiàng)鑒定后,得到了一些突變株。對(duì)該突變株進(jìn)行生物活性測(cè)定,并對(duì)統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行分析后得到了突變株2-23,該突變株對(duì)棉鈴蟲(chóng)的殺蟲(chóng)毒力較野生株有了明顯地提高。
　　 在對(duì)突變株2-23 CrylAc蛋白進(jìn)行鏡檢和SDS—PAGE分析后,發(fā)現(xiàn)其與

4、野生株相比在顯微形態(tài)學(xué)和SDS—PAGE檢測(cè)結(jié)果上區(qū)別并不大。但對(duì)其生測(cè)的結(jié)果表明突變株2-23產(chǎn)生的蛋白對(duì)棉鈴蟲(chóng)的毒力較野生株有明顯的提高。在提取突變株2-23的pHT315ptAc質(zhì)粒并對(duì)其進(jìn)行DNA測(cè)序后發(fā)現(xiàn)突變株2-23 crylAc基因的第497位發(fā)生了基因突變,使CrylAc蛋白第166位的氨基酸由天冬酰胺突變?yōu)榻z氨酸。經(jīng)過(guò)分析得知該位點(diǎn)的突變提高了α5螺旋整體的疏水性,使α5螺旋在與受體結(jié)合時(shí)更有利于與疏水脂質(zhì)界面相結(jié)合,