冬蟲夏草Hirsutella sinensis G67的高通量發(fā)酵與多糖的構(gòu)效研究.pdf

1、近年來，野生冬蟲夏草資源的有限性與逐年增長的市場需求矛盾日益突出，利用液體發(fā)酵方法生產(chǎn)冬蟲夏草菌絲體和胞外多糖具有周期短、產(chǎn)量高、質(zhì)量穩(wěn)定等優(yōu)點，是工業(yè)生產(chǎn)菌絲體和胞外多糖等冬蟲夏草替代品的高效、節(jié)能方式。不同菌株對培養(yǎng)條件的要求差異很大，經(jīng)過優(yōu)化培養(yǎng)可以提高菌絲體和胞外多糖的產(chǎn)量，這些胞外多糖一般都具有潛在的生物學(xué)活性。本文對一株經(jīng)多年馴化的冬蟲夏草Hirsutella sinensis G67菌株胞外多糖和菌絲體的高通量發(fā)酵條件及其

2、多糖的構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行了研究。確定了該菌株的液體發(fā)酵條件及多糖提取工藝，并采用分級醇沉的方法分別獲得三個胞內(nèi)多糖(IPS)片段和三個胞外多糖(EPS)片段。用高效凝膠滲透色譜法(HPGPC)、氣相色譜法(GC)、紅外光譜掃描法(FTIR)及化學(xué)方法分析了不同多糖片段的基本結(jié)構(gòu)特性，評價了胞外多糖和胞內(nèi)多糖的體外吸濕保濕性能、抗氧化活性和抑菌活性，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步通過方差分析、相關(guān)性分析和線性分析等統(tǒng)計學(xué)方法分析了多糖基本性質(zhì)與活性的關(guān)系。主

3、要研究結(jié)果如下:
　　1.利用單因素和響應(yīng)面試驗優(yōu)化Hirsutella sinensis G67高通量發(fā)酵的營養(yǎng)成分和培養(yǎng)條件。最佳培養(yǎng)基組成為:蔗糖29.05g/L，酵母膏5.31g/L;NaNO31.33g/L，K2HPO42.10g/L，MgSO4·7H2O0.78g/L，添加200g/L土豆（煮汁）;最適發(fā)酵條件為:初始pH6.0，裝液量100mL/250mL，接種量10％，培養(yǎng)溫度25℃。上述條件下培養(yǎng)72h，胞外多糖

4、和菌絲體產(chǎn)量分別達(dá)到5.87g/L和15.92g/L（干重）。30L全自動發(fā)酵罐試驗中發(fā)酵周期縮短至60 h，EPS產(chǎn)量和生物量分別為5.82g/L和15.90g/L，表明該菌株的發(fā)酵能夠?qū)崿F(xiàn)放大，有望應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。
　　2.多糖提取工藝的確定。胞外多糖的提取:將發(fā)酵液濃縮至原體積的1/6，pH調(diào)節(jié)至8.0;胞內(nèi)多糖的最佳提取工藝:菌絲體凍融后加8倍水（質(zhì)量比），100℃、60min沸水浸提一次，浸提液濃縮6倍，pH調(diào)節(jié)至8.

5、0。用1倍、2倍、4倍乙醇依次對多糖進(jìn)行分級醇沉，分別得到3個胞外多糖片段(EPS-1，EPS-2，EPS-3)和3個胞內(nèi)多糖片段(IPS-1，IPS-2，IPS-3)，分別以EPS-3和IPS-3的百分含量最高。胞外多糖和胞內(nèi)多糖的提取率分別為89.7％和17.5％（以干重計）。3.多糖基本性質(zhì)的測定及對比。低乙醇倍數(shù)沉降所得多糖（EPS-1和IPS-1）的蛋白含量較高（19.86％和33.97％），糖含量相對較低（70.71％和52

6、.71％），分子量較大((43.0kDa和23.1kDa);而高乙醇倍數(shù)沉降所得多糖（EPS-3和IPS-3）的糖含量（92.64％和85.55％）則相對較高，蛋白含量降低（2.00％和1.90％），分子量相對較小(4.7kDa和10.4kDa)。不同乙醇倍數(shù)沉降所得多糖的單糖組分也不同，EPS-1、EPS-2、IPS-1和IPS-2由甘露糖、半乳糖和葡萄糖組成，而EPS-3和IPS-3則不含半乳糖;各多糖片段的單糖組成比例也存在一定差

7、異，隨著所用乙醇倍數(shù)的增加，所得胞內(nèi)多糖的甘露糖含量逐漸下降（由59.0％下降至27.2％），而葡萄糖含量逐漸升高（由8.5％上升至72.8％）。多糖中存在少量的糖醛酸，不同多糖片段之間的含量差異不明顯。紅外光譜分析也表明不同多糖片段結(jié)構(gòu)基本一致，相似性很高。
　　4.多糖體外生物學(xué)活性評價。對Hirsutella sinensis G67液體發(fā)酵多糖的吸濕保濕性能、抗氧化活性和抑菌活性分別進(jìn)行了評價:胞內(nèi)多糖和胞外多糖具有很好的

8、吸濕保濕性能，保濕性能僅次于透明質(zhì)酸，而遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于甘油;多糖對羥自由基和超氧自由基有一定的清除能力，并且能很好的螯合亞鐵離子，呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系;另外，多糖對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有廣譜抑菌性，對白色念珠菌也有較好的抑制作用。
　　5.多糖生物學(xué)活性的構(gòu)效分析。多糖性質(zhì)對活性的影響明顯:分子量較大的多糖片段保濕性能更好，而分子量較小的多糖吸濕性能更強;甘露糖含量較高的多糖片段對·OH自由基的清除作用更強，半乳糖含量高的多糖片段