位點(diǎn)不依賴(lài)性乳腺表達(dá)載體的構(gòu)建及在乳腺上皮細(xì)胞中的表達(dá).pdf

1、本文旨在建立位點(diǎn)不依賴(lài)性乳腺特異性表達(dá)載體，以克服轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)中因位置效應(yīng)影響而導(dǎo)致的表達(dá)效率低下的問(wèn)題。同時(shí)通過(guò)對(duì)內(nèi)源性β-酪蛋白表達(dá)與否的檢測(cè)來(lái)篩選出有泌乳功能的乳腺上皮細(xì)胞體系，在細(xì)胞水平對(duì)所構(gòu)建的乳腺特異性表達(dá)載體的合理性、有效性進(jìn)行檢測(cè)。 引進(jìn)含有隔離子序列的pWHERE2v.01質(zhì)粒，對(duì)pWHERE2v.01質(zhì)粒進(jìn)行改造，去除隔離子序列間的LacZ基因序列，將回收的片段修飾環(huán)化得到新的質(zhì)粒pWHERE-1(6844

2、bp)。將目的蛋白BLG-VP2分離，定向克隆入改造后pWHERE-1質(zhì)粒的兩個(gè)隔離子序列之間，構(gòu)建成pW-BLG-VP2位點(diǎn)不依賴(lài)性乳腺表達(dá)載體。 從泌乳期山羊乳腺組織分離得到山羊乳腺上皮細(xì)胞體系GMEC，應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)技術(shù)和免疫組化方法對(duì)GMEC細(xì)胞中β-酪蛋白表達(dá)與否進(jìn)行檢測(cè)以評(píng)價(jià)GMEC乳蛋白合成的功能。同時(shí)，比較商品化小鼠乳腺癌細(xì)胞C127、人乳腺癌細(xì)胞系T47D中β-酪蛋白基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。