AMPK對(duì)小鼠乳腺上皮細(xì)胞增殖和乳腺發(fā)育的影響.pdf

1、目的：
　　5’單磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPK）是真核生物中被公認(rèn)的能量調(diào)節(jié)感受器。本研究旨在構(gòu)建AMPK dominant negative轉(zhuǎn)基因小鼠，觀察AMPK活性抑制后對(duì)乳腺上皮細(xì)胞增殖及乳腺發(fā)育的影響，觀察AMPK激活劑二甲雙胍對(duì)乳腺發(fā)育的作用，探究是否有惡性化腫瘤的形成。
　　方法：
　　1.利用外源性α-flag修飾AMPK突變片段構(gòu)建AMPK dominant negative轉(zhuǎn)基因鼠（以下簡(jiǎn)稱DN）

2、，采用PCR及免疫組化的方法檢測(cè)靶基因和蛋白的表達(dá)以檢測(cè)轉(zhuǎn)基因鼠的構(gòu)建成功。
　　2.采用Whole Mount的方法，觀察比較4~30不同周齡、妊娠期5 d/10 d/17 d及哺乳期2 d DN和WT雌鼠乳腺全組織形態(tài)的變化情況；并通過HE以及PCNA染色進(jìn)一步觀察AMPK活性降低對(duì)小鼠乳腺上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)及增殖的影響。
　　3.用5 mg/ml濃度二甲雙胍腹腔注射4周齡、妊娠期5天和10天WT小鼠7天，Whole moun

3、t觀察青春期導(dǎo)管的形態(tài)學(xué)變化。
　　結(jié)果：
　　1. RT-PCR鑒定AMPK DN基因型，目的條帶為500bp。利用Q-PCR檢測(cè)α-flag片段在小鼠乳腺中基因RNA水平的表達(dá)，顯示W(wǎng)T中并無表達(dá)。另外，免疫組化進(jìn)一步證實(shí)α-flag蛋白在DN小鼠上皮細(xì)胞中表達(dá)，且p-AMPK表達(dá)下降，提示轉(zhuǎn)基因鼠的構(gòu)建成功。
　　2.青春期，AMPK活性降低對(duì)小鼠乳腺導(dǎo)管的延伸和擴(kuò)展進(jìn)程無顯著變化，然而，5w DN小鼠中導(dǎo)管終端

4、TEB逐漸增多，較WT小鼠差異有統(tǒng)計(jì)意義；5w、6w時(shí)，TEB面積均較WT組大，p<0.05，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；同時(shí)，HE及PCNA顯示促進(jìn)成熟導(dǎo)管上皮的細(xì)胞增殖及增厚。妊娠期，DN和WT組乳腺發(fā)育無明顯區(qū)別，哺乳期DN小鼠腺泡內(nèi)腔大于WT小鼠，p<0.05，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3.形態(tài)學(xué)上，二甲雙胍能抑制妊娠期初期乳腺導(dǎo)管發(fā)育。
　　結(jié)論：
　　AMPK dominant negative（DN）轉(zhuǎn)基因鼠