狼毒寧B抗乳腺癌血管生成的藥理作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究目的：
　　一直以來(lái)，乳腺癌作為全球女性中發(fā)病率和致死率最高的癌癥而受到醫(yī)藥學(xué)專家的高度關(guān)注，其中，乳腺癌的轉(zhuǎn)移是其致復(fù)發(fā)和致死的最主要原因。本課題的研究對(duì)象狼毒寧B(Chamaejasmnin B，ICJ)是從瑞香科狼毒屬的植物瑞香狼毒（Stellerachamaejasme L.）中提取的黃酮類化合物。本課題組的前期研究結(jié)果顯示，ICJ可以通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、侵襲能力，抑制乳腺癌的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化進(jìn)程，進(jìn)而抑制乳腺癌的

2、腫瘤轉(zhuǎn)移。同時(shí)，ICJ還能夠從微環(huán)境的角度，在低劑量狀態(tài)下，對(duì)腫瘤微環(huán)境中的巨噬細(xì)胞功能和TGF-β平衡具有明確的調(diào)節(jié)活性。然而，腫瘤的新生血管作為腫瘤轉(zhuǎn)移的最主要途徑和第一站，在腫瘤轉(zhuǎn)移中起到了至關(guān)重要的作用，而狼毒寧B是否能夠調(diào)控腫瘤的血管生成過(guò)程，此研究領(lǐng)域尚屬空白。本課題將根據(jù)前期工作提示，以乳腺癌微環(huán)境為基礎(chǔ)，在體內(nèi)、外水平探索ICJ抗乳腺癌腫瘤血管生成的藥效作用，并以乳腺癌微環(huán)境中的血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能性改變?yōu)榍腥朦c(diǎn)，進(jìn)行機(jī)制

3、的發(fā)掘和研究，探索“ICJ-乳腺癌細(xì)胞-血管內(nèi)皮細(xì)胞”的相互作用關(guān)系以及ICJ在乳腺癌微環(huán)境的重塑中發(fā)揮的作用。
　　研究方法：
　　1.ICJ體外抑制乳腺癌血管生成的藥效學(xué)研究
　　采用人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilicalvein endothelial cells，HUVEC)建立共培養(yǎng)模型和腫瘤條件培養(yǎng)基過(guò)繼轉(zhuǎn)移模型，模擬乳腺癌微環(huán)境進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。首先，采用MTT法檢測(cè)了

4、ICJ對(duì)MDA-MB-231以及腫瘤條件培養(yǎng)基對(duì)HUVEC的增殖影響，以不明顯影響細(xì)胞的生存為前提，確定了體外ICJ的作用濃度和時(shí)間(0.5、2、8μg/mL，24 h)。在這兩個(gè)模型下，通過(guò)劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)(Wound healing)檢測(cè)HUVEC增殖、運(yùn)動(dòng)能力變化;Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HUVEC的遷移、趨化能力變化;通過(guò)毛細(xì)血管網(wǎng)形成實(shí)驗(yàn)（Capillary-like tube formation）觀察HUVEC細(xì)胞出芽、移行、

5、成管的能力。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)的體外3D培養(yǎng)，在離體組織水平觀察血管生成的情況。
　　2.ICJ體內(nèi)抑制乳腺癌血管生成的藥效學(xué)研究
　　在體外藥效得到驗(yàn)證的基礎(chǔ)上，在體內(nèi)水平，首先使用4T1細(xì)胞注射于BalB/c小鼠第四對(duì)乳房墊一側(cè)，構(gòu)建了小鼠乳腺癌原位移植瘤模型(Xenograftmodel)，小鼠分為模型對(duì)照組、ICJ處理組(30、150、750μg/kg)，腹腔注射給藥，1次/d，持續(xù)25d。通過(guò)對(duì)小鼠腹壁

6、血管的形態(tài)學(xué)觀察和腫痛血管標(biāo)志分子CD146免疫組化檢測(cè)，評(píng)價(jià)ICJ抑制原位乳腺痛血管生成情況。其次，使用4T1細(xì)胞腹部皮下埋植構(gòu)建了C57BL/6小鼠基質(zhì)膠體內(nèi)埋植模型(Matrigel plug)。小鼠分為陰性對(duì)照組、模型對(duì)照組、ICJ處理組(30、150、750μg/kg)，腹腔注射給藥，1次/d，持續(xù)7d。通過(guò)觀察基質(zhì)膠的顏色和重量、Drabkin's法檢測(cè)基質(zhì)膠內(nèi)的血紅蛋白含量、免疫組化法檢測(cè)基質(zhì)膠內(nèi)的CD146表達(dá)，在體內(nèi)水

7、平綜合評(píng)價(jià)ICJ對(duì)乳腺癌血管生成的藥效作用。
　　3.ICJ抑制乳腺癌血管生成的機(jī)制研究
　　首先，在光鏡下觀察了ICJ對(duì)HUVEC形態(tài)特征的影響;使用透射電鏡觀察了HUVEC細(xì)胞的超顯微結(jié)構(gòu);使用間接免疫熒光法結(jié)合共聚焦顯微鏡觀察，觀察了HUVEC細(xì)胞中LC3的亞細(xì)胞定位;使用Western Blot對(duì)自噬標(biāo)志性分子LC3Ⅰ/Ⅱ、Beclin-1的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)。同時(shí)，使用AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞

8、術(shù)檢測(cè)、caspase-3活性的檢測(cè)以及使用Western Blot檢測(cè)Bik的表達(dá)，排除了ICJ對(duì)乳腺癌微環(huán)境中的HUVEC具有凋亡誘導(dǎo)作用。為研究自噬與血管生成之間是否具有相關(guān)性，分別使用Bafilomycin A1和Beclin-1 shRNA轉(zhuǎn)染的方法從外源和內(nèi)源兩個(gè)方面阻斷自噬，觀察HUVEC成管能力變化。在自噬和血管生成之間具有因果關(guān)系的前提下，使用RT-PCR檢測(cè)MDA-MB-231中VEGFA的mRNA水平，使用West

9、ern Blot法檢測(cè)阻斷自噬前后HUVEC中的VEGFR2表達(dá)水平，并通過(guò)免疫共沉淀法檢測(cè)了LC3Ⅱ和VEGFR2的相互作用，較為系統(tǒng)地對(duì)ICJ通過(guò)誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬抑制血管生成的機(jī)制進(jìn)行了探索。最后，使用ELISA法對(duì)共培養(yǎng)體系中TNF-α的水平進(jìn)行了檢測(cè)，對(duì)在腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞中介導(dǎo)自噬誘導(dǎo)信號(hào)的分子進(jìn)行了初步探索。
　　研究結(jié)果：
　　1.ICJ體外抑制乳腺癌血管生成的藥效學(xué)研究
　　在腫瘤細(xì)胞-血管內(nèi)皮

10、細(xì)胞共培養(yǎng)模型和腫瘤條件培養(yǎng)基過(guò)繼轉(zhuǎn)移模型中，①M(fèi)TT結(jié)果顯示，2～8μg/mL韻ICJ對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞作用24h，對(duì)細(xì)胞生存抑制率均在10％以下，2～8μg/mL的ICJ處理后條件培養(yǎng)基(Post ICJ treatedconditional medium)對(duì)HUVEC的抑制率均低于20％;而進(jìn)一步提高ICJ濃度或延長(zhǎng)作用時(shí)間即會(huì)對(duì)兩株細(xì)胞產(chǎn)生較明顯的生存抑制作用。綜合考慮了劑量和時(shí)間因素，最終選擇0.5、2、8μg/mL的

11、ICJ處理24h作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的處理?xiàng)l件;②劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在初始劃痕寬度一致的前提下，ICJ處理組的HUVEC在24h之后，劃痕寬度明顯大于對(duì)照組(P＜0.01)，且具有劑量依賴性;③Transwell結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，ICJ處理組的HUVEC穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少(P＜0.01)，且具有劑量依賴性;④成管實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，ICJ處理組的HUVEC細(xì)胞出芽率明顯下降（0.5μg/mL組，P＜0.01;2、8tg/mL組

12、，P＜0.001），形成完整、封閉的管腔數(shù)目減少;⑤大鼠主動(dòng)脈環(huán)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，ICJ處理組主動(dòng)脈環(huán)周圍形成的毛細(xì)血管數(shù)目明顯減少，斷裂增多，并表現(xiàn)出明顯的劑量依賴性（P＜0.01）。
　　2.ICJ體內(nèi)抑制乳腺癌血管生成的藥效學(xué)研究
　　在乳腺癌原位移植瘤模型中，可以觀察到:①在形態(tài)學(xué)水平，模型對(duì)照組小鼠的新生血管數(shù)量多，管徑粗，突出腹壁，呈現(xiàn)樹根狀。低劑量ICJ給藥組腹壁血管數(shù)減少，管徑變細(xì)，隨著劑量的增加，

13、腹壁血管數(shù)目和分支數(shù)進(jìn)一步減少，管徑變細(xì)。其中，中劑量ICJ的抑制血管生成作用最明顯。②在組織學(xué)水平，免疫組化結(jié)果顯示，CD146在模型對(duì)照組的腫瘤組織中;，呈現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，且組織中可見較多的血管樣結(jié)構(gòu)，而ICJ的干預(yù)可以明顯減少腫瘤組織內(nèi)部的血管結(jié)構(gòu)，并且明顯減弱CD146的表達(dá)。
　　在基質(zhì)膠皮下埋植模型中，可以觀察到:①與陰性對(duì)照組相比，模型對(duì)照組埋植體顏色呈深紅色，體積及重量大(P＜0.01); ICJ的處理可以使埋植體顏

14、色明顯變淺，并顯著減小埋植體的體積和重量（與模型組相比，P＜0.05和P＜0.01），其中，ICJ0.15 mg/kg劑量組的抑制作用最明顯。②Drabkin's檢測(cè)結(jié)果顯示，模型對(duì)照組的埋植體內(nèi)血紅蛋白含量較陰性對(duì)照組明顯升高（P＜0.01），而ICJ處理組的血紅蛋白含量下降，且中劑量結(jié)果最明顯，與模型組相比，由非常顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。③CD146的免疫組化結(jié)果顯示，在陰性對(duì)照組中，無(wú)陽(yáng)性信號(hào);在模型組中CD146表達(dá)量明

15、顯增高，且有大量靜脈、動(dòng)脈和毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)的形成;在ICJ處理組，CD146表達(dá)量明顯降低，腫瘤細(xì)胞數(shù)目和血管結(jié)構(gòu)減少。
　　3.ICJ抑制乳腺癌血管生成的機(jī)制研究
　?、僭诠忡R下，對(duì)照組中的HUVEC形態(tài)正常，排列致密，ICJ處理組的HUVEC細(xì)胞形狀不規(guī)則，排列紊亂疏松。②在透射電鏡下，對(duì)照組HUVEC細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)正常，而ICJ處理組的HUEVC細(xì)胞中出現(xiàn)大量自噬小體，且呈劑量依賴性。③間接免疫熒光結(jié)果顯示，對(duì)照組的HU

16、VEC中，LC3呈彌散狀均勻分布，表達(dá)強(qiáng)度較弱;而ICJ處理組中，LC3呈現(xiàn)點(diǎn)狀、聚集性分布，表達(dá)強(qiáng)度增加，且具有劑量依賴性;④Western Blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，ICJ的處理能夠明顯上調(diào)HUVEC中LC3Ⅱ的表達(dá)水平，下調(diào)LC3Ⅰ的表達(dá)水平，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值明顯上升(P＜0.05，P＜0.01);同時(shí)，Beclin-1的表達(dá)水平也明顯上調(diào);ICJ的作用具有明確的劑量依賴性。
　　對(duì)HUVEC細(xì)胞凋亡相關(guān)的檢測(cè)

17、結(jié)果發(fā)現(xiàn):①AnnexinⅤ-FITC/PI雙染結(jié)果顯示，ICJ各個(gè)劑量對(duì)HUVEC細(xì)胞的凋亡率無(wú)明顯影響。②ICJ各劑量處理對(duì)HUVEC中的caspase-3酶活性均無(wú)明顯影響，與對(duì)照組比較，差異無(wú)顯著性。③ICJ各個(gè)劑量處理后，對(duì)Western Blot方法檢測(cè)的HUVEC中凋亡標(biāo)志性分子Bik蛋白表達(dá)亦無(wú)明顯影響。
　　研究結(jié)論：
　　綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，做出結(jié)論如下:
　　(1)ICJ在體內(nèi)外均可以抑制乳腺癌細(xì)胞

18、誘導(dǎo)的血管生成進(jìn)程;
　　(2)ICJ可誘導(dǎo)乳腺癌微環(huán)境中的血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生非凋亡依賴性的自噬，并通過(guò)自噬過(guò)程中LC3Ⅱ與VEGFR2的相互作用，降低血管內(nèi)皮細(xì)胞中VEGFR2的水平，阻斷血管生成信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而抑制乳腺癌的血管生成;
　　(3)ICJ可以誘導(dǎo)乳腺癌微環(huán)境中產(chǎn)生誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬的可溶性分子，TNF-α和ANGPTL-4可能于此相關(guān)。
　　(4)ICJ通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤微環(huán)境中的血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生自噬進(jìn)而抑制