WT1在乳腺癌進(jìn)展中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、乳腺癌是女性最常見(jiàn)和死亡率最高的惡性腫瘤。侵襲轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤重要的生物學(xué)特征，也是導(dǎo)致乳腺癌患者死亡的主要原因，但具體過(guò)程和機(jī)理至今尚不明確。因此，進(jìn)一步研究乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制并探索有效的防控措施，對(duì)提高患者的生存率和生存質(zhì)量具有重要意義。惡性腫瘤的發(fā)生和侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程受多層次、多因素調(diào)控，癌基因與抑癌基因作用的失衡是其中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。因此，尋找新的或進(jìn)一步揭示已有癌基因或抑癌基因的功能，對(duì)闡明惡性腫瘤發(fā)生和演進(jìn)機(jī)理、研發(fā)潛在治療靶點(diǎn)具

2、有重要意義。
　　 Wilms瘤基因1(Wilms'tumor gene 1，WT1)首先在腎母細(xì)胞瘤(又稱Wilms瘤)中作為抑癌基因被克隆鑒定，定位于11p13。WT1編碼產(chǎn)物是一種具有轉(zhuǎn)錄激活和抑制雙重功能的鋅指轉(zhuǎn)錄因子。在發(fā)育過(guò)程中，WT1通過(guò)調(diào)控多種靶基因和信號(hào)通路參與心臟、腎臟和脾臟等器官的形成。研究表明WT1在成體組織中的異常表達(dá)與多種惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，但根據(jù)細(xì)胞特征不同，其可發(fā)揮癌基因或抑癌基因作用。一方面

3、，在Wilms瘤等兒童惡性腫瘤中，WT1通過(guò)干擾細(xì)胞增殖信號(hào)等途徑抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，發(fā)揮抑癌基因作用；另一方面，WT1可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞得抗凋亡能力，并通過(guò)調(diào)控原癌基因K-ras促進(jìn)細(xì)胞增殖，提示W(wǎng)T1也能發(fā)揮癌基因作用。
　　 根據(jù)目前關(guān)于WT1與乳腺癌的臨床研究結(jié)果，多數(shù)學(xué)者傾向于認(rèn)為WT1在乳腺癌中發(fā)揮癌基因作用，但該結(jié)論并未得到所有研究團(tuán)隊(duì)的證實(shí)、仍存一定爭(zhēng)議。系統(tǒng)回顧WT1在乳腺癌領(lǐng)域的研究成果，我們發(fā)現(xiàn)：WT1的表達(dá)情況與乳

4、腺癌患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系至今尚無(wú)明確結(jié)論，尤其是其在乳腺癌不同分子亞型中的表達(dá)是否存在差異未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。同時(shí)，WT1在乳腺癌進(jìn)展中的具體作用和機(jī)制至今尚不清楚，其促進(jìn)還是抑制細(xì)胞增殖尚存爭(zhēng)議，而其是否參與乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程、具體作用及分子機(jī)制如何，未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。此外，雖然已知WT1可調(diào)控下游多種生長(zhǎng)因子發(fā)揮生物學(xué)作用，但對(duì)其上游調(diào)控機(jī)制的研究和認(rèn)識(shí)甚少。
　　 針對(duì)上述問(wèn)題，本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法挖掘、分析已公布的基

5、因芯片數(shù)據(jù)，闡明WT1 mRNA與乳腺癌分子亞型及患者預(yù)后的關(guān)系；通過(guò)免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry，IHC)的方法檢測(cè)乳腺癌組織WT1蛋白表達(dá)情況，并分析其與患者臨床病理特征的關(guān)系。采用RNA干擾(RNA interfering，RNAi)技術(shù)下調(diào)WT1表達(dá)，采用RNA激活(RNA activating，RNAa)技術(shù)上調(diào)WT1表達(dá)，借此分析WT1在乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡、周期、侵襲及遷移中的作用，并以細(xì)胞增殖及

6、轉(zhuǎn)移關(guān)鍵分子-抑制分化抑制因子1(inhibitor of differentiation1)為切入點(diǎn)初步探討WT1發(fā)揮生物學(xué)功能的分子機(jī)制。同時(shí)，通過(guò)建立轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factorβ1，TGF-β1)誘導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchyrmal transition，EMT)細(xì)胞模型，探索TGF-β1對(duì)WT1的調(diào)控作用及效應(yīng)；通過(guò)對(duì)TGF-β1單核甘酸多態(tài)性(singl

7、e nucleotide polymorphisms，SNPs)與乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系進(jìn)行meta分析，進(jìn)一步揭示其與乳腺癌發(fā)生的關(guān)系。通過(guò)上述研究以期初步探討WT1在乳腺癌進(jìn)展中的作用及分子機(jī)制，為進(jìn)一步揭示W(wǎng)T1在惡性腫瘤中生物學(xué)行為提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為惡性腫瘤的分子靶點(diǎn)的研發(fā)提供新的思路。
　　 實(shí)驗(yàn)方法和主要結(jié)果：
　　 1.WT1與乳腺癌原發(fā)腫瘤特征及預(yù)后的關(guān)系
　　 方法：利用生物信息學(xué)的方法挖掘包含26

8、6例乳腺癌患者的GSE21653基因芯片數(shù)據(jù)，分析WT1 mRNA表達(dá)水平與乳腺癌分子亞型及預(yù)后的關(guān)系；免疫組織化學(xué)法檢測(cè)46例乳腺癌組織WT1蛋白表達(dá)情況，分析其與患者臨床病理特征的關(guān)系。
　　 結(jié)果：在GSE21653中，WT1 mRNA在組織學(xué)分級(jí)高(G2 VS.G1，P=0.0260；G3 VS。G1，P=8.04e-5)、ER陰性(ER陰性VS.ER陽(yáng)性，P=0.0500)、Basal-like型及ERBB2/HER-

9、2過(guò)表達(dá)型(Basal-like型vs.Luminal A型，P=0.0049；Basal-like型vs.Luminal型，P=0.0350；ERBB2/HER-2過(guò)表達(dá)型vs.Luminal型，P=0.0350)的乳腺癌患者中表達(dá)水平明顯升高。單變量分析顯示W(wǎng)T1 mRNA高表達(dá)患者的無(wú)病生存率顯著低于低表達(dá)患者(風(fēng)險(xiǎn)比[HR]=3.294，95％可信區(qū)間[CI]=1.198-9.055，P=0.014)，多變量分析顯示W(wǎng)T1是乳腺

10、癌患者的獨(dú)立預(yù)后不良因素(HR=3.4539，95％CI=1.2029-9.918，P=0.0213；WT1 mRNA高表達(dá)患者vs.WT1 mRNA低表達(dá)患者)。在46例乳腺癌患者中，WT1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為84.8％(39/46)。WT1表達(dá)與患者年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、淋巴結(jié)分期、TNM分期、ER、PR、HER-2狀態(tài)及分子亞型均無(wú)明顯關(guān)系(P>0.05)。
　　 2.WT1在乳腺癌中的生物學(xué)作用及下游信號(hào)分子機(jī)制初步探討

11、
　　 方法：qRT-PCR、Western blotting(WB)和免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)WT1在人乳腺癌MCF-7、Bcap-37、SKBR-3及MDA-MB-321細(xì)胞中的表達(dá)情況，篩選WT1高表達(dá)和低表達(dá)細(xì)胞。以國(guó)外學(xué)者提供的三條序列為靶點(diǎn)構(gòu)建WT1小干擾RNA(siRNA)以沉默表達(dá)WT1，以文獻(xiàn)公布的、已證實(shí)可上調(diào)表達(dá)WT1的序列構(gòu)建雙鏈RNA(dsRNA)以過(guò)表達(dá)WT1，通過(guò)脂質(zhì)體法分別轉(zhuǎn)染MDA-MB-321和MC

12、F-7細(xì)胞，通過(guò)qRT-PCR和WB篩選作用效果最明顯的siRNA和dsRNA。利用CCK8、Annexin V/PI及transwell法觀測(cè)干擾WT1表達(dá)后對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡、周期、侵襲及遷移能力的影響。同時(shí)通過(guò)qRT-PCR和WB檢測(cè)干擾WT1后對(duì)細(xì)胞Id1蛋白表達(dá)水平的影響。
　　 結(jié)果：WT1在MDA-MB-321中的表達(dá)水平明顯高于其在MCF-7、Bcap-37和SKBR-3中的表達(dá)水平，確定以MDA-MB-23

13、1作為RNAi細(xì)胞模型、以MCF-7作為RNAa細(xì)胞模型。成功構(gòu)建三個(gè)WT1 siRNA并轉(zhuǎn)染到MDA-MB-231細(xì)胞中，均能夠有效抑制WT1 mRNA和蛋白的表達(dá)，以轉(zhuǎn)染48h時(shí)WT1 siRNA-1029的效果最為顯著。使用WT1 siRNA-1029轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞、干擾其WT1表達(dá)后，細(xì)胞的增殖能力下降，同時(shí)早期、晚期凋亡細(xì)胞和G1期細(xì)胞比例增加，S期和G2期細(xì)胞比例降低，細(xì)胞的侵襲及遷移能力降低；干擾WT1可下調(diào)

14、Id1蛋白的表達(dá)水平并使細(xì)胞的侵襲遷移能力下降。成功將WT1 dsRNA-319轉(zhuǎn)染到MCF-7細(xì)胞中，在50μ mol/L、轉(zhuǎn)染96h時(shí)WT1 dsRNA-319對(duì)MCF-7細(xì)胞WT1的過(guò)表達(dá)作用最為顯著，且這一過(guò)程伴隨MCF-7細(xì)胞增殖、侵襲及遷移能力的增高。
　　 3.TGF-β1調(diào)控WT1表達(dá)的效應(yīng)觀察研究及TGF-β1單核甘酸多態(tài)性與乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)關(guān)系的meta分析
　　 方法：使用TGF-β1(濃度：10ng

15、/ml，作用時(shí)間：48h)誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞，觀察細(xì)胞形態(tài)變化、WT1 mRNA、蛋白水平改變情況以及細(xì)胞侵襲遷移能力變化。利用計(jì)算機(jī)檢索截止2010年3月MEDLINE、PubMed、Web of Science、EMBASE、CNKI、萬(wàn)方、VIP和中國(guó)生物醫(yī)學(xué)服務(wù)系統(tǒng)(SinoMed)等數(shù)據(jù)庫(kù)中有關(guān)TGF-β1 T869C和C-509T多態(tài)性與乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)關(guān)系的研究，根據(jù)納入標(biāo)準(zhǔn)提取有效數(shù)據(jù)后，采用STATA軟件進(jìn)行meta分析

16、。
　　 結(jié)果：加入TGF-β1可使乳腺癌MCF-7細(xì)胞由上皮細(xì)胞樣形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)細(xì)胞樣形態(tài)，這一過(guò)程伴隨WT1 mRNA和蛋白表達(dá)水平的顯著升高，同時(shí)還可使MCF-7細(xì)胞的侵襲及遷移能力明顯增高。Meta分析結(jié)果顯示，TGF-β1基因T869C多態(tài)性的C等位基因與總體人群乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)關(guān)(C vs.T：OR=1.033，95％CI=0.996-1.072)，但亞群分析顯示其與高加索人乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增高有關(guān)(C vs.T：OR

17、=1.051，95％CI=1.018-1.085；CC vs.TT+TC：OR=1.083，95％CI=1.019-1.151)；TGF-β1基因C-509T多態(tài)性的T等位基因與總體人群乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)關(guān)(T vs.C：OR=0.986.95％CI=0.936-1.039)。
　　 結(jié)論：
　　 1、WT1在乳腺癌中發(fā)揮癌基因樣功能，可增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移能力，導(dǎo)致乳腺癌惡性程度增加。依據(jù)有：
　　

18、①WT1在組織學(xué)分級(jí)高、ER陰性的Basal-like型、HER-2過(guò)表達(dá)型的乳腺癌中表達(dá)水平顯著增高，WT1高表達(dá)可能是乳腺癌患者的獨(dú)立預(yù)后不良因素；
　　 ②干擾WT1表達(dá)可使MDA-MB-231細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移能力降低，而過(guò)表達(dá)WT1可使MCF-7細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移能力升高。
　　 2、TGF-β1可能是WT1的上游調(diào)控分子，而Id1可能是WT1的下游靶分子。依據(jù)有：
　　 ①TGF-β1可上調(diào)M