扶正解毒方對荷瘤小鼠腫瘤相關巨噬細胞介導下血管重塑的調控研究.pdf

1、胃癌的復發(fā)和轉移是一直困擾臨床醫(yī)生和限制臨床療效提高的重要難題。近年來研究表明，腫瘤免疫抑制微環(huán)境是腫瘤細胞賴以生存的基礎，對促進腫瘤生長、逃避免疫監(jiān)視、形成微血管方面起著重要作用。已經(jīng)完成的國家自然基金課題(NO.81072802)扶正解毒法對HIF-α介導的腫瘤相關巨噬細胞(TAM)促微淋巴管生成的調控研究顯示扶正解毒方可以誘導腫瘤間質中的TAM向M1型轉化，逆轉腫瘤組織中的乏氧環(huán)境和免疫抑制狀態(tài)，抑制微淋巴管的生成，其機制與干預P

2、I3K/AKT/mTOR通路有關，同時發(fā)現(xiàn)扶正解毒方對移植瘤微血管生成亦有一定的調節(jié)作用。
　　研究目的：
　　本實驗以此為基礎，進一步探討扶正解毒方對荷瘤小鼠模型腫瘤相關巨噬細胞介導下血管重塑的調控機制。
　　研究方法:
　　造模:建立移植性前胃癌小鼠荷瘤模型(參照國家自然基金項目NO.81072802)，將實驗動物隨機分為對照組、中藥組（扶正解毒方）、化療組(5-Fu)、中西醫(yī)結合組（結合組），分別給予相應藥

3、物干預14天。作用觀察:觀察扶正解毒中藥對前胃癌小鼠荷瘤模型移植瘤的生長及抑制情況，用超聲檢測小鼠移植瘤血管分布及血流參數(shù)，采用尾靜脈注射熒光染料和腹腔注射乏氧探針的方法觀察腫瘤組織的血流灌注量和乏氧狀況。機制探討:用FACS法檢測各組小鼠CD4+/CD8+T細胞比值、Treg細胞含量，RT-PCR檢測血管生成因子VEGF、MMP-9、COX-2、及免疫抑制因子IL-6、1L-10，趨化因子CCL-17、Arg-1分泌水平，Wester

4、nblot和IHP法檢測血管生成素、UPR以及核心通路mTOR相關因子表達的情況。
　　研究結果:
　　1.荷瘤小鼠移植瘤的瘤重及抑制率
　　對照組瘤重最高，為1.29±0.39g，藥物干預后，各治療組瘤重降低，中藥組、化療組、結合組的瘤重分別為0.93±0.37g、0.62±0.30g、0.48±0.24g;按照抑瘤率計算公式中藥組、化療組、結合組的瘤重抑制率分別為28.20％、52.09％、62.59％。
　

5、　2.超聲觀察各組小鼠腫瘤的血管分布及血流參數(shù)檢測
　　對照組腫瘤組織血流豐富，血管密集、雜亂地分布于腫瘤周邊，管徑較細，缺少典型、深入瘤體中心的較大血管。中藥組腫瘤組織血流豐富程度不及對照組，然而其血管集中、規(guī)則，往往有1～2個深入瘤體中心的較大血管?；熃M、結合組也有部分集中深入瘤體內部的血管，但血管普遍較少，血流信號不明顯。各組小鼠瘤內血流參數(shù)PSV、EDV、RI值均為:中藥組＞對照組＞化療組＞結合組。各組小鼠瘤體內血管Al

6、der分級程度亦與血流參數(shù)情況類似，中藥組分級程度最高，其次分別為對照組、化療組、結合組，差異有統(tǒng)計學意義。
　　3.腫瘤組織內的血流灌注及乏氧狀況
　　腫瘤組織內的血流灌注量依次為對照組＞中藥組＞化療組＞結合組。其乏氧嚴重程度亦為對照組＞中藥組＞化療組＞結合組，對照組乏氧情況最嚴重，藥物干預后，治療組乏氧狀況輕度改善。
　　4.對腫瘤相關巨噬細胞免疫抑制微環(huán)境的影響
　　對照組腫瘤組織CD4+/CD8+T細胞比

7、值為1.45±0.09，處于一個較低的水平，而脾組織Treg細胞的相對含量較高（2.50±0.56），且高表達M2型巨噬細胞的特征性免疫抑制因子IL-6、IL-10和趨化因子CCL-17、Arg-1，提示腫瘤微環(huán)境處于免疫抑制狀態(tài)。扶正解毒中藥干預后，腫瘤微環(huán)境CD4+/CD8+T細胞比值得到一定程度的提高（1.72±0.14），聯(lián)合化療組（1.96±0.31）效果最為明顯;Treg細胞含量降低，中藥組、化療組、結合組分別為1.37±0

8、.44、1.67±0.20、1.15±0.55，免疫抑制因子表達水平也降低。
　　5.對腫瘤相關巨噬細胞促血管生成因子表達的影響
　　移植瘤中對照組VEGFa、MMP-9、COX-2基因的轉錄水平最高，經(jīng)藥物治療后，各組目標基因轉錄水平均有降低趨勢，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計學意義，結合組降低效果最為明顯。VEGFa基因表達水平為對照組＞化療組＞中藥組＞結合組;MMP-9、COX-2基因表達水平為對照組＞中藥組＞化療組＞結合

9、組，MMP-9基因表達水平結合組與中藥組、化療組相比，降低水平明顯，而COX-2為化療組、結合組的基因表達水平明顯低于對照組、中藥組，差異有統(tǒng)計學意義。
　　對照組移植瘤高表達Ang-1、Ang-2，經(jīng)藥物治療后其蛋白表達水平均降低，差異有統(tǒng)計學意義。Ang-1蛋白的表達水平為對照組＞中藥組＞化療組＞結合組，其中結合組與中藥組、化療組相比，差異顯著，有統(tǒng)計學意義;對照組Ang-2蛋白表達水平最高，經(jīng)藥物治療后各治療組蛋白表達水平降

10、低，差異有統(tǒng)計學意義，而各治療組之間相互比較，差異無統(tǒng)計學意義。
　　6.對Rheb/mTOR/p70S6K1信號通路的調控
　　對照組高表達PI3K、Rheb、p70S6K1蛋白，中藥干預后，PI3K、Rheb表達水平降低，結合組降低最為明顯，對照組與各治療組之間，差異有統(tǒng)計學意義。p70S6K1蛋白中藥組和結合組有降低的趨勢，與對照組相比，僅結合組差異有統(tǒng)計學意義。
　　對照組mTOR、AKT、TSC1蛋白的光密度

11、值較高，藥物干預后表達水平降低。與對照組相比，mTOR蛋白中藥組和結合組的的光密度值降低明顯;AKT蛋白結合組光密度值最低，與對照組、中藥組相比，差異有統(tǒng)計學意義;中藥組、化療組TSC1蛋白光密度值較對照組降低，結合組最少，差異有統(tǒng)計學意義。
　　7.對腫瘤微環(huán)境中非折疊蛋白反應(UPR)的調控
　　對照組GRP-78蛋白表達水平較高，經(jīng)藥物干預后其表達水平降低，各治療組與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義;化療組GRP-78的表

12、達水平最低，但各治療組之間差異無統(tǒng)計學意義。
　　ATF-6、IRE1α、PERK對照組的光密度值最高，藥物干預后降低。ATF-6、IRE1α蛋白結合組的光密度值最低，各治療組與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義;PERK蛋白經(jīng)中藥干預后，蛋白的光密度值降低，聯(lián)合化療未見效果更為明顯。
　　研究結論:
　　扶正解毒中藥能有效抑制前胃癌荷瘤小鼠模型移植瘤的生長，減少腫瘤血管生成，同時促進腫瘤局部的血流灌注，改善腫瘤微環(huán)境的乏氧