載RANKL的磷酸鈣骨水泥-聚乳酸-羥基乙酸微球復(fù)合物促進(jìn)體內(nèi)破骨細(xì)胞樣細(xì)胞生成的研究.pdf

1、目的:研究載RANKL的磷酸鈣骨水泥/聚乳酸-羥基乙酸微球復(fù)合物在體內(nèi)促進(jìn)破骨細(xì)胞樣細(xì)胞生成的作用，為促進(jìn)磷酸鈣材料降解提出新思路，為該類生物材料發(fā)展新的策略提供科學(xué)依據(jù)。
　　方法:本實(shí)驗(yàn)由兩個(gè)部分組成:
　　1.載RANKL的CPC/PLGA微球復(fù)合物的制備及RANKL的體外檢測(cè)
　　W/O/W復(fù)乳法制備PLGA微球，掃描電鏡觀察。將5ml含A組)0.5ug/ml、B組）1.0 ug/ml、C組）1.5 ug/ml

2、的RANKL溶液分別與0.2g PLGA微球混合，冷凍干燥。0.8g CPC分別與0.2g A、B、C組PLGA微球加0.35ml固化液調(diào)拌，制成直徑6mm、高2mm的試樣。將預(yù)固化24h的A、B、C組試樣浸漬于1.5ml PBS溶液，37℃孵育。于1h、7天、14天、21天、28天、35天和42天采液，ELISA法檢測(cè)RANKL釋放量。收集余液，根據(jù)RANKL的釋放結(jié)果，配成50ml含100ng/ml RANKL+10％胎牛血清+DM

3、EM培養(yǎng)液，培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞至第8天，抗酒石酸酸性磷酸酶染色。
　　2.載RANKL的CPC/PLGA微球復(fù)合物的皮下植入
　　設(shè)A組（含0.5ug/ml RANKL的CPC/PLGA）、B組（含1.0ug/ml RANKL的CPC/PLGA）、C組(含1.5ug/ml RANKL的CPC/PLGA)D組（不含RANKL的CPC/PLGA對(duì)照組）(n=4)。建立SD大鼠背部皮下植入模型，每只大鼠背部植入4個(gè)試樣。觀察

4、4、8、12周，取材，脫鈣，HE染色和免疫組織化學(xué)染色觀察材料周圍軟組織的形態(tài)變化、破骨細(xì)胞樣細(xì)胞(Osteoclast-likecell，OLC)的生成情況和RANKL的陽(yáng)性表達(dá)情況。
　　結(jié)果:1.W/O/W復(fù)乳法制備的PLGA微球呈球狀或橢球狀，表面圓整，其平均粒徑為19±8 um。
　　2.RANKL體外釋放結(jié)果顯示:A、B、C組在前7天釋放較快，隨后進(jìn)入緩釋階段。各組在1h時(shí)均可檢測(cè)到RANKL，7天時(shí)檢測(cè)到釋放高

5、峰，35天各組仍能檢測(cè)到少量RANKL，42天時(shí)檢測(cè)不到RANKL。各組前7天RANKL釋放量占總釋放量的百分比為A組62.7％，B組62.5％，C組52.4％，組間無顯著差異(P＞0.05)。28天，各組RANKL釋放量占總釋放量的百分比為A組98.1％，B組97.2％，C組96.1％，組間無顯著差異。A、B、C組RANKL總釋放量占所投入的RANKL量百分比分別為31.0％、17.6％、14.7％，A組與B組、A組與C組比較均有顯著

6、性差異(P＜0.05)，B、C兩組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　3.抗酒石酸酸性磷酶染色結(jié)果顯示:培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞至第8天時(shí)，CPC/PLGA/RANKL浸提液組可見TRAP(+)的OLC。該類細(xì)胞體積較大，形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)有紅色或深紅色染色顆粒，細(xì)胞密度較稀疏。對(duì)照組無TRAP(+)的OLC。
　　4.HE染色結(jié)果顯示:第4周，材料周圍軟組織可見少量散在的淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞，毛細(xì)血管和成纖維細(xì)胞增生，形成纖維囊包裹材料

7、，纖維囊腔側(cè)可見OLCs。在OLC計(jì)數(shù)和胞核計(jì)數(shù)、炎性細(xì)胞反應(yīng)和纖維囊分級(jí)方面，各組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。第8周，各組OLC細(xì)胞數(shù)及胞核數(shù)較第4周均增多(P＜0.05)，各組細(xì)胞數(shù)比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。A組與D組間胞核數(shù)比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在炎性細(xì)胞反應(yīng)和纖維囊分級(jí)方面，各組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。第12周，A、B、C、D組間細(xì)胞數(shù)比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，與第8周比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。胞核計(jì)數(shù)，A、D兩組間以及B、D兩組間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，A組第

8、12周較第4、8周增多。在炎性細(xì)胞反應(yīng)和纖維囊分級(jí)方面，各組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　5.免疫組化染色結(jié)果顯示:4周時(shí)，A、B、C組RANKL陽(yáng)性表達(dá)較對(duì)照組強(qiáng)，A組與B、C、D各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，B組和D組，C組和D組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);第8周，A、B、C組RANKL陽(yáng)性表達(dá)較對(duì)照組強(qiáng)，且比第4周強(qiáng)，A組與B、C、D各組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，B組和D組，C組和D組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;第12周，