磷酸鈣骨水泥-聚乳酸-羥基乙酸復(fù)合微球?qū)Τ晒羌?xì)胞RANKL和OPG因子表達(dá)的影響.pdf

1、目的：
　　研究磷酸鈣骨水泥/聚乳酸羥基乙酸復(fù)合微球(Calcium phosphatecement/poly(lactic-co-glycolic acid) microspheres，CPC/PLGA)的降解液對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響及成骨細(xì)胞相關(guān)因子RANKL及OPG表達(dá)的作用，從而為進(jìn)一步闡明PLGA促進(jìn)CPC降解的機(jī)制提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　第一部分:PLGA和CPC/PLGA降解乳酸和羥基乙酸濃度的選擇

2、
　　一、PLGA和CPC/PLGA降解乳酸和羥基乙酸的濃度變化
　　(1) PLGA降解液的制備
　　將0.4gPLGA粉末放置于5 mL DMEM完全培養(yǎng)基，并于5％CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于15d、30d、45d、60d、75d后收集液體，用高效液相色譜儀（HPLC）檢測(cè)乳酸和羥基乙酸含量。
　　(2) CPC/PLGA降解液的制備
　　稱取400mg CPC/PLGA混合物加入200μlNa

3、2HPO4溶液進(jìn)行調(diào)拌，并加入5mlDMEM完全培養(yǎng)基，于5％CO2，37℃培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)，分別于15d、30d、45d、60d、75d后收集液體，用高效液相色譜儀(HPLC)檢測(cè)乳酸和羥基乙酸含量。
　　二、各實(shí)驗(yàn)組乳酸和羥基乙酸濃度的選擇
　　通過(guò)高效液相色譜儀(HPLC)測(cè)量各組PLGA和CPC/PLGA降解生成的聚乳酸和羥基乙酸濃度，用MTT實(shí)驗(yàn)篩選適宜成骨細(xì)胞增殖的濃度。再根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇羥基乙酸和乳酸的最終

4、濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　第二部分:CPC/PLGA降解液對(duì)成骨細(xì)胞的影響
　　取24h之內(nèi)的SD乳鼠顱骨，通過(guò)兩步消化法獲得成骨細(xì)胞，在含有血清的DMEM培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)分為四組:1.對(duì)照組（成骨細(xì)胞）;2.CPC組（CPC+成骨細(xì)胞）;3.PLGA組（PLGA+成骨細(xì)胞）;4.CPC/PLGA組（CPC/PLGA+成骨細(xì)胞），將四組降解液與成骨細(xì)胞共培養(yǎng)。利用四唑鹽比色試驗(yàn)(MTT)檢測(cè)第1、3、5、7、9天時(shí)，各

5、組的吸光度值，并繪制生長(zhǎng)曲線，計(jì)算相對(duì)增殖率。并通過(guò)茜素紅鈣結(jié)節(jié)染色(21d)、堿性磷酸酶活性檢測(cè)(分別培養(yǎng)1、3、5、7d)和PCR檢測(cè)骨鈣素含量(分別培養(yǎng)1、3、5、7d)來(lái)探討CPC、PLGA及CPC/PLGA復(fù)合物降解初期對(duì)成骨細(xì)胞增殖和分化能力的影響。通過(guò)RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中RANKLmRNA和OPG mRNA的表達(dá)，探討CPC/PLGA降解初期對(duì)成骨細(xì)胞相關(guān)因子RANKL和OPG的作用，試圖闡明RANKL-RANK-OPG

6、調(diào)控軸是如何受到PLGA影響，從而促進(jìn)CPC產(chǎn)生降解的機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　1.PLGA降解液中乳酸和羥基乙酸的濃度
　　在PLGA浸泡至45d時(shí)，羥基乙酸濃度為(23.685±0.54)mg/L，乳酸濃度為(3.996±0.57)mg/L。
　　2.CPC/PLGA降解液中乳酸和羥基乙酸的濃度
　　CPC/PLGA降解液中羥基乙酸的濃度從15d的(2.028±0.049)mg/L開始順著時(shí)間的推移出現(xiàn)提

7、升，60d時(shí)到達(dá)峰值(7.320±0.034) mg/L，隨后逐漸下降75d時(shí)為(4.256±0.046) mg/L。而乳酸濃度變化趨勢(shì)不明顯，降解曲線近乎平緩:15d時(shí)為(0.171±0.024) mg/L，45d為（0.14±0.051）mg/L，而到75d為(0.091±0.038) mg/L。
　　3.CPC/PLGA降解液對(duì)成骨細(xì)胞的影響
　　根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，成骨細(xì)胞在培養(yǎng)的第三天進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，而到了第七

8、天曲線變得平緩，細(xì)胞增殖速率減慢。CPC組和CPC/PLGA組與CON組相比，增殖能力有所增強(qiáng)（P＜0.05）;PLGA組與CON組相比，增殖能力降低（P＜0.05）。PLGA組與其他三組相比，經(jīng)過(guò)21d培養(yǎng)后鈣結(jié)節(jié)沉淀不明顯。CPC/PLGA組堿性磷酸酶活性在3、5、7d均高于對(duì)照組（P＜0.05），且明顯高于PLGA組(P＜0.01);PLGA組低于空白對(duì)照組(P＜0.05)。RT-PCR結(jié)果顯示:CPC/PLGA組骨鈣素的表達(dá)在3

9、、5、7d均高于其它三組(P＜0.05);PLGA組在5、7d低于空白對(duì)照組(P＜0.05)。成骨細(xì)胞在培養(yǎng)的1、3、5、7d里，CPC/PLGA組和PLGA組RANKL表達(dá)高于CON組(P＜0.05)，CPC組與CON組相比RANKL表達(dá)差異不明顯;相比于CON組CPC/PLGA組RANKL的表達(dá)水平在3d時(shí)處于高峰期（P＜0.01），PLGA組RANKL的表達(dá)水平在7d時(shí)處于高峰期（P＜0.01）。成骨細(xì)胞在培養(yǎng)的1、3、5d里，C