載骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞磷酸鈣骨水泥的制備.pdf

1、一、研究背景
　　隨著現(xiàn)代科學(xué)的進(jìn)步，人們的生活步入了現(xiàn)代化，高速鐵路、飛機(jī)、汽車遍布周圍，高能量的損傷越來(lái)越多，組織缺損及功能障礙越來(lái)越常見(jiàn)。與此同時(shí)，人們的需求也在與時(shí)俱進(jìn)，并不單純的講究保全生命，而是追求更高的生活品質(zhì)，追求功能的恢復(fù)及重建。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展，從上世紀(jì)80年代中期開(kāi)始，組織工程——一個(gè)新興的概念開(kāi)始興起。根據(jù)美國(guó)國(guó)家科學(xué)基金委員會(huì)的定義，組織工程是指應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)、生物材料和工程學(xué)的原理，研究開(kāi)發(fā)用于修復(fù)或

2、改善人體病損組織或器官的結(jié)構(gòu)、功能的生物活性替代物的一門科學(xué)。對(duì)于創(chuàng)傷而言，各種原因?qū)е碌墓侨睋p都嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，傳統(tǒng)的自體骨移植不但犧牲了自體健康的組織，且由于供區(qū)體積限制，很多情況下并不能完全修復(fù)骨質(zhì)缺損。而骨組織工程的出現(xiàn)，為解決這個(gè)困擾骨科界數(shù)十年的問(wèn)題展現(xiàn)了曙光。骨組織工程是指應(yīng)用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、成骨細(xì)胞等相關(guān)合適的種子細(xì)胞，在各種可吸收的支架材料上種植，輔以具有相關(guān)生物活性的細(xì)胞因子，如骨形態(tài)發(fā)生蛋白（Bone mo

3、rphogenetic protein,BMP）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（Transforming Growth Factor,TGF）等，修復(fù)缺損的骨組織，實(shí)現(xiàn)安全、有效、無(wú)副作用的醫(yī)療境界。在本課題中，試圖對(duì)傳統(tǒng)的磷酸鈣骨水泥加以改進(jìn)，使之具有骨誘導(dǎo)性、速代謝性，高強(qiáng)度性，從而研制一種新型的骨替代材料，為大范圍骨質(zhì)缺損的修復(fù)提供一種新的選擇。
　　二、研究目的
　　通過(guò)實(shí)驗(yàn)將包含大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）的明膠微球載入到磷酸

4、鈣骨水泥（CPC）中并使之存活，利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的多向分化潛能促進(jìn)磷酸鈣骨水泥的降解及骨誘導(dǎo)活性，從而研制一種新的具有生物活性的骨替代材料。
　　三、研究?jī)?nèi)容和方法
　　1.分離、培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞
　　我們選用大鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為種子細(xì)胞。通過(guò)傳統(tǒng)的貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并對(duì)其進(jìn)行傳代、鑒定，確保最終實(shí)驗(yàn)所用的為分裂穩(wěn)定，具有多向分化潛能的干細(xì)胞。
　　2.制備載骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的明膠

5、微球
　　取1皿第三代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞用胰酶消化備用，將一定量的明膠顆粒溶于 DMEM培養(yǎng)基制備成13％的明膠溶液，取5ml溶液緩慢加入1ml細(xì)胞懸液，混勻后與橄欖油25ml均預(yù)熱至50℃。橄欖油中加入0.15mL Span-80后緩慢加入明膠溶液，于磁力攪拌儀上以900r/min攪拌15min后加入0.01g京尼平于室溫下繼續(xù)攪拌。為測(cè)試不同交聯(lián)度對(duì)明膠微球穩(wěn)定性的影響，分別交聯(lián)12h、24h、48h。后混合物驟冷至4℃，與含5

6、g/L Tween-80的PBS液以1:1比例置于分液漏斗，清洗3次以去除橄欖油獲得明膠微球。置于 DMEM培養(yǎng)基中于細(xì)胞培養(yǎng)箱保存?zhèn)溆谩?br>　　3.制備載骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的磷酸鈣骨水泥
　　為確定合適的構(gòu)成比，將載有 MSCs的明膠微球與骨水泥分別按質(zhì)量比2.5％（B）、5％（C）、10％（D）（w/w）充分混合后與磷酸鹽緩沖液按固液相2:1的比例混合為半流質(zhì)糊狀物后置入預(yù)先備好的圓柱體模具中于37℃孵箱中固化4h后脫模后于

7、DMEM培養(yǎng)基中保存?zhèn)溆?。另制備單純CPC（A）作為空白對(duì)照。
　　4.測(cè)定載干細(xì)胞明膠微球的理化性質(zhì)
　　觀察明膠微球的外形、分散度，計(jì)算其細(xì)胞包封率、平均粒徑及溶脹率，用茚三酮法測(cè)定明膠微球的交聯(lián)度，觀察微球的降解時(shí)間。
　　5.熒光染色觀察微球內(nèi)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞
　　將明膠微球浸入 DMEM中，用鈣黃綠素 AM和碘化丙啶(PI)染色后分別于2h、12h、24h于熒光顯微鏡下觀察，其中綠色熒光表明細(xì)胞存活，

8、紅色熒光表明細(xì)胞死亡。
　　6.測(cè)定新型骨水泥的理化性質(zhì)
　　表征新型磷酸鈣骨水泥的初凝時(shí)間、抗壓強(qiáng)度，計(jì)算其孔隙率及代謝時(shí)間，分析其代謝產(chǎn)物，觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在孔隙內(nèi)的粘附及生長(zhǎng)情況。
　　7.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( x±s)表示。采用AVONA方法，SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　四、研究結(jié)果
　　1.所培

9、養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞已穩(wěn)定傳至第三代，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，本實(shí)驗(yàn)分離、培養(yǎng)的MSCs符合國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)。MSCs CD90表達(dá)為陽(yáng)性，陽(yáng)性率達(dá)到95.24％，而CD45則表達(dá)為陰性。
　　2.明膠微球的理化性質(zhì)觀察交聯(lián)時(shí)間控制在24h內(nèi)各組明膠微球的粒徑變化不大，分別為(75±15)μm、(81.58±24.68)μm和(108.64±37.44)μm，24h后微球粒徑明顯減小為(27.88±7.46)μm，差異具有顯著性(P<0.05)

10、；交聯(lián)過(guò)的明膠微球降解時(shí)間明顯延長(zhǎng)，較未交聯(lián)組差異差異具有顯著性(P<0.05)。
　　3.磷酸鈣骨水泥的理化性質(zhì)觀察在各組CPC中MSCs均生長(zhǎng)良好，且與空白對(duì)照組比較，隨著明膠微球比例的增大，各組CPC的抗壓強(qiáng)度逐步降低，初凝時(shí)間延長(zhǎng)，孔隙率增大，大孔率增高(P<0.05)。
　　五、研究結(jié)論
　　1、本實(shí)驗(yàn)分離、培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)。
　　2、通過(guò)對(duì)明膠微球的理化性質(zhì)測(cè)定，京尼平交聯(lián)24h后的