載阿倫磷酸鈉PLGA微球的磷酸鈣骨水泥復(fù)合組織工程骨修復(fù)兔股骨髁骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：骨缺損的治療是骨科醫(yī)生及科研工作者經(jīng)常面臨的難題。創(chuàng)傷、感染和骨腫瘤等致病因素導(dǎo)致的骨缺損難以自身愈合，其引起的功能喪失將影響患者的治療效果和生活質(zhì)量。在骨缺損的臨床治療中，經(jīng)常遇到結(jié)構(gòu)性骨缺損，以及骨折愈合不良、愈合困難甚至不愈合，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致骨不連等。臨床上用于修復(fù)骨缺損的替代材料包括自體骨移植、同種異體骨移植和人工骨材料。自體骨移植是目前臨床治療骨缺損的金標(biāo)準(zhǔn)，其是指移植的骨組織在同一個(gè)體的體內(nèi)，由一處移向另一處。人體某些部

2、位的骨組織被取出后，基本不會(huì)遺留明顯的功能障礙，而這些部位的骨組織往往是自體骨移植的理想供骨。自體骨移植所需的松質(zhì)骨常取自鎖骨或者髂骨，所需的皮質(zhì)骨常取自脛骨或者腓骨。自體骨具有極高的成骨能力和很小的免疫反應(yīng)，但卻存在增加額外的創(chuàng)傷、來(lái)源極為有限、延長(zhǎng)手術(shù)時(shí)間、增加失血量和手術(shù)感染的潛在可能性以及持續(xù)的慢性疼痛等缺點(diǎn)，從而限制了其臨床應(yīng)用。同種異體骨移植是指同種類的一個(gè)個(gè)體給另一個(gè)個(gè)體的骨組織移植。移植的骨組織具有不同的遺傳特征，同受體

3、組織會(huì)發(fā)生較為嚴(yán)重的免疫排斥反應(yīng)及疾病傳播的潛在危險(xiǎn)。其中，由同一結(jié)合子發(fā)育而來(lái)的兩個(gè)個(gè)體間的骨組織移植，稱為同基因骨組織移植。在這種情況下，兩個(gè)個(gè)體的遺傳特征較為接近，可無(wú)免疫排斥反應(yīng)或僅有輕微的排斥反應(yīng)。同種異體骨移植雖然來(lái)源比自體骨移植豐富，但其仍然存在免疫排斥反應(yīng)、愈合緩慢以及可能導(dǎo)致疾病的傳播與交叉感染等問(wèn)題。人工骨材料是指一類可對(duì)機(jī)體骨組織進(jìn)行修復(fù)、替代與再生，具有特殊功能作用的骨組織替代材料。該類人工材料在臨床的應(yīng)用，為患

4、者較快的恢復(fù)正常的生理結(jié)構(gòu)和功能提供了可能，同時(shí)也避免了采用自體骨移植和同種異體骨移植所帶來(lái)的各種問(wèn)題。人工骨材料按結(jié)構(gòu)或性質(zhì)可分為無(wú)機(jī)骨材料、有機(jī)骨材料和復(fù)合骨材料。人工骨材料可填充骨缺損部位，但不能誘導(dǎo)新生的骨組織生成，人工骨材料的材料學(xué)、生物學(xué)性能以及降解能力等問(wèn)題均有待進(jìn)一步解決。構(gòu)建復(fù)合骨替代材料即組織工程骨成為當(dāng)今骨缺損治療研究的熱點(diǎn)，將促進(jìn)骨愈合的藥物與基質(zhì)材料混合后聯(lián)合治療骨缺損是近來(lái)研究較多的一種方法。本項(xiàng)研究采用復(fù)乳

5、溶劑蒸發(fā)法制備載阿侖膦酸鈉PLGA微球并將其與磷酸鈣骨水泥混合構(gòu)建構(gòu)的載阿倫磷酸鈉/磷酸鈣骨水泥復(fù)合組織工程骨，首先對(duì)其進(jìn)行載藥量及其釋放規(guī)律、孔徑大小、孔隙率和力學(xué)性能等材料學(xué)特性的研究;其次通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)觀察其對(duì)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及成骨誘導(dǎo)能力的效果評(píng)價(jià)其體外生物相容性和成骨性;最后通過(guò)構(gòu)建兔股骨髁骨缺損模型，將載阿倫磷酸鈉/PLGA/磷酸鈣復(fù)合組織工程骨植入骨缺損部位，通過(guò)影像學(xué)和組織學(xué)指標(biāo)評(píng)價(jià)其體內(nèi)生物相容性和成骨性。本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)

6、旨在研究制備搭載阿倫磷酸鈉的PLGA微球與磷酸鈣骨水泥復(fù)合后的組織工程骨，評(píng)估其體外和體內(nèi)生物相容性和成骨活性，探討其修復(fù)兔股骨髁骨缺損的效果及加速修復(fù)骨缺損的作用。本項(xiàng)研究有望能為臨床促進(jìn)骨缺損區(qū)修復(fù)提供一種新的治療方法。本項(xiàng)研究分為以下三部分:(1)阿倫磷酸鈉/PLGA/CPC組織工程骨的材料學(xué)性質(zhì)研究;(2)阿倫磷酸鈉/PLGA/CPC組織工程骨的體外生物相容性和成骨分化活性的研究;(3)阿倫磷酸鈉/PLGA/CPC組織工程骨的體

7、內(nèi)生物相容性和促進(jìn)骨缺損愈合的研究。
　　方法：⑴運(yùn)用復(fù)乳溶劑蒸發(fā)法(W/O/W)制備載阿倫磷酸鈉PLGA微球。采用JSM-6390掃描電鏡觀察微球的微觀形態(tài)，測(cè)量其粒徑大小和分布情況;采用酶標(biāo)儀測(cè)定載阿倫磷酸鈉PLGA微球的載藥和緩釋性能。微球與磷酸鈣骨水泥混合制備阿倫磷酸鈉/PLGA/CPC復(fù)合組織工程骨。采用阿基米德法測(cè)定組織工程骨的孔隙率;采用JSM-6390掃描電鏡測(cè)量組織工程骨的孔徑大小;采用RGD-5型萬(wàn)用測(cè)試儀測(cè)定

8、組織工程骨的力學(xué)性能。⑵Percoll密度梯度分離法獲取兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)，體外培養(yǎng)純化，倒置顯微鏡觀察其生長(zhǎng)狀態(tài)。分別將阿倫磷酸鈉/PLGA/CPC復(fù)合組織工程骨和單純PLGA/CPC組織工程骨與生長(zhǎng)狀況良好的第三代兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)，通過(guò)掃描電鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài);采用CCK-8活細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞的黏附和增殖;采用流式細(xì)胞周期測(cè)定材料對(duì)于細(xì)胞周期的影響;堿性磷酸酶活性和堿性磷酸酶染色評(píng)估其對(duì)細(xì)胞的成骨分化活性。

9、⑶山東大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供的45只健康新西蘭成年大白兔(23雌，22雄;體重2.0-3.0kg)，手術(shù)建立股骨髁骨缺損的模型，隨機(jī)分為A、B、C3組，每組15只。A組為假手術(shù)組（單純股骨髁骨缺損組），B組骨缺損后植入PLGA/CPC組織工程骨，C組骨缺損后植入阿倫磷酸鈉/PLGA/CPC復(fù)合組織工程骨。每只動(dòng)物均一側(cè)行手術(shù)操作。術(shù)后6周和12周分批處死動(dòng)物后取材評(píng)估，行大體解剖觀察、X線攝片、Micro-CT掃描分析（骨覆蓋率和骨密度值

10、）和組織學(xué)觀察。
　　結(jié)果：①?gòu)?fù)乳溶劑蒸發(fā)法(W/O/W)成功制備出外表圓潤(rùn)、粒徑200-300μm、粒徑分布均勻的載阿倫磷酸鈉PLGA微球。載阿倫磷酸鈉PLGA微球與單純PLGA微球的外觀、粒徑大小和分布沒(méi)有明顯差異。PLGA微球?qū)τ诎惲姿徕c的載藥率為75.12％,可緩慢釋放阿倫磷酸鈉達(dá)28天。載阿侖膦酸鈉/PLGA/CPC復(fù)合材料孔隙率67.43±4.2％，孔徑213±95μm，抗壓強(qiáng)度達(dá)到5.79±1.21Mp，與松質(zhì)骨相

11、當(dāng)，可基本滿足臨床要求。載阿侖膦酸鈉/PLGA/CPC復(fù)合材料與PLGA/CPC材料的孔隙率、孔徑和抗壓強(qiáng)度沒(méi)有明顯差異。②載阿侖膦酸鈉/PLGA/CPC復(fù)合材料在體外對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有著良好的體外生物相容性和成骨分化活性。載阿侖膦酸鈉/PLGA/CPC復(fù)合組織工程骨與細(xì)胞粘附性良好，粘附細(xì)胞的形態(tài)正常。載阿侖膦酸鈉/PLGA/CPC復(fù)合組織工程骨組的黏附、增殖性顯著增高(P＜0.05)。細(xì)胞接種后，載阿侖膦酸鈉/PLGA/CPC復(fù)合

12、組織工程骨組的細(xì)胞的分裂增殖速度顯著高于單純PLGA/CPC組織工程骨和空白對(duì)照組(P＜0.05)。載阿侖膦酸鈉/PLGA/CPC復(fù)合組織工程骨組的堿性磷酸酶活性顯著增高(P＜0.05)，堿性磷酸酶染色的陽(yáng)性細(xì)胞也顯著高于單純PLGA/CPC組織工程骨和空白對(duì)照組。③兔股骨髁骨缺損動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示載阿侖膦酸鈉/PLGA/CPC復(fù)合組織工程骨同樣有著良好的體內(nèi)生物相容性和成骨分化活性。植入后6周和12周，復(fù)合材料組的骨缺損修復(fù)均優(yōu)于對(duì)照組。假

13、手術(shù)組（單純股骨髁骨缺損組）股骨髁骨缺損未見明顯愈合;X線攝片示骨缺損處透光明顯;Micro-CT顯示骨覆蓋率(bonecoverage)在6周和12周分別為3.40±2.25％和6.10±4.48％，骨密度值(BMD)在6周和12周分別為31.04±5.8mg/cm3和50.80±8.8mg/cm3;HE染色顯示骨缺損處可見大量的纖維細(xì)胞，少見新骨形成。PLGA/CPC組織工程骨組股骨髁骨缺損見部分愈合;X線攝片示骨缺損處透光較弱;M

14、icro-CT顯示骨覆蓋率在6周和12周分別為12.89±5.74％和20.24±9.25％，骨密度值在6周和12周分別為57.08±8.4mg/cm3和81.80±10.8mg/cm3;HE染色示骨缺損處可見少量的纖維細(xì)胞，可見部分新骨形成，但新生骨小梁較為薄弱。阿倫磷酸鈉/PLGA/CPC復(fù)合組織工程骨組股骨髁骨缺損見基本愈合;X線攝片示骨缺損處透光最弱;Micro-CT顯示骨覆蓋率在6周和12周分別為25.78±6.89％和45.

15、06±11.62％，骨密度值在6周和12周分別為88.92±9.9mg/cm3和115.98±12.2mg/cm3;HE染色示骨缺損處可見極少量的纖維細(xì)胞，可見大量的新骨形成，新生骨小梁粗大。
　　結(jié)論：⑴PLGA是良好的阿倫磷酸鈉的載體和緩釋體，載阿倫磷酸鈉的PLGA微球在降解后可使阿倫磷酸鈉緩慢釋放。⑵載阿倫磷酸鈉/PLGA/CPC復(fù)合組織工程骨具有良好的材料學(xué)性能，有合適的孔徑結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能。⑶體外實(shí)驗(yàn)顯示載阿倫磷酸鈉/PL