實驗性關節(jié)炎相關長鏈非編碼RNAs的篩選、功能研究及黃芪總皂苷的干預作用.pdf

1、類風濕關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種全身性、自身免疫性疾病，以慢性炎癥、滑膜細胞異常增生、關節(jié)腫脹與壓痛為其臨床特征，可導致關節(jié)功能受限、工作能力喪失，給患者和社會帶來沉重的負擔。RA好發(fā)于35~50歲人群，女性發(fā)病率約為男性2~3倍。目前，RA具體發(fā)病機制尚不清楚，認為可能與免疫因素、環(huán)境因素、遺傳等有關。因此，積極探索RA的發(fā)病機制，尋找潛在診斷標志物具有重要的理論與現(xiàn)實意義。
　　以前關于RA

2、機制的研究主要集中在編碼基因。近年來，越來越多的研究表明長期以來被視為“噪音”和“暗物質”的非編碼RNAs（non-coding RNAs，ncRNAs），具有復雜的生物學功能。ncRNAs中的長鏈非編碼RNAs（long non-coding RNAs，LncRNAs）是由基因組中非編碼序列轉錄生成的、長度大于200nt、不具有翻譯成蛋白質能力的轉錄本，在表觀遺傳水平、轉錄水平、翻譯水平、蛋白修飾過程中均可發(fā)揮重要的調控作用，與多種疾

3、病密切相關。但目前對RA發(fā)生、發(fā)展過程中 LncRNAs的調控作用仍知之甚少。
　　目前，西醫(yī)臨床上對于RA的治療，主要以減輕疼痛、控制癥狀為主，長期應用副反應明顯，患者多不能耐受或依從性差，遠程療效不理想。因此，從傳統(tǒng)中藥中開發(fā)治療 RA的藥物，越來越受到重視。黃芪為豆科植物蒙古黃芪 Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongolicus(Bge.) Hsiao或膜莢黃芪Astraga

4、lus membranaceus（Fisch.） Bge.的干燥根，具有行滯通痹、補氣升陽、利水消腫等功效，為中醫(yī)臨床實踐中常用藥材。黃芪總皂苷（Astragalosides，AST）是黃芪的有效部位群，主要含有黃芪皂苷I~VIII等。現(xiàn)代藥理學研究表明，AST具有抗炎、抗氧化、免疫調節(jié)、抗衰老等多種藥理作用。
　　本課題擬在課題組前期研究的基礎上，開展如下研究：（1）實驗性關節(jié)炎相關長鏈非編碼RNAs的篩選及黃芪總皂苷的干預作用

5、；（2）基于LncRNA-miRNA-mRNA共表達網絡篩選實驗性關節(jié)炎發(fā)病過程中關鍵 LncRNAs；（3） LncRNA S56464.1靶向miR-152/Wnt通路誘導成纖維樣滑膜細胞（fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS）增殖及黃芪總皂苷干預作用等研究，以期系統(tǒng)、深入地揭示LncRNAs在實驗性關節(jié)炎發(fā)生、發(fā)展中所扮演的角色及黃芪總皂苷的干預作用，從 LncRNAs的角度揭示實驗性關節(jié)炎的發(fā)病機理，

6、并闡明黃芪總皂苷治療實驗性關節(jié)炎的可能機制。
　　第一部分：實驗性關節(jié)炎相關長鏈非編碼RNA的篩選及黃芪總皂苷的干預作用
　　目的：篩選實驗性關節(jié)炎發(fā)病過程中差異表達的長鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs, LncRNAs)，探討實驗性關節(jié)炎可能的發(fā)病機制及黃芪總皂苷可能的作用靶點。
　　方法：采用大鼠LncRNA基因芯片檢測佐劑性關節(jié)炎（adjuvant arthritis，AA）大鼠滑膜組織中

7、LncRNAs/mRNAs表達情況，以Fold change值>1.5，P-value<0.05篩選差異表達基因，進行基因本體論（Gene Ontology，GO）和信號通路（Pathway）分析，構建差異表達基因LncRNA-mRNA共表達網絡，篩選關鍵差異LncRNAs并采用實時熒光定量PCR技術對其進行驗證。
　　結果：正常組和模型組共篩選出260個差異表達的 LncRNAs，其中模型組中上調LncRNAs表達譜數(shù)據(jù)170個

8、，下調LncRNAs表達譜數(shù)據(jù)90個；獲得675個差異表達的mRNAs，模型組中上調mRNAs表達譜數(shù)據(jù)422個，下調mRNAs表達譜數(shù)據(jù)253個；共獲得4163個GO條目，其中上調差異基因富集于2494個GO條目，下調差異基因富集于1669個GO條目；獲得42條與差異基因相關的信號通路，其中上調差異基因富集于25條信號通路，下調差異基因富集于17條信號通路；6個關鍵LncRNAs（XR_008357, U75927, MRAK0462

9、51, XR_006457, DQ266363和 MRAK003448）實時熒光定量PCR檢測結果與基因芯片的結果相一致。
　　正常組、模型組和AST組共篩選出75個差異表達的LncRNAs，與正常組和AST組相比，模型組上調LncRNAs表達譜數(shù)據(jù)41個，下調LncRNAs表達譜數(shù)據(jù)34個；篩選出247個差異表達的mRNAs，模型組中上調mRNAs表達譜數(shù)據(jù)171個，下調mRNAs表達譜數(shù)據(jù)76個；共獲得135個GO條目，其中上

10、調差異基因富集于117個GO條目，下調差異基因富集于18個GO條目；共獲得17條與差異基因相關的信號通路，其中上調差異基因富集于14條信號通路，下調差異基因富集于3條信號通路；4個關鍵LncRNAs(MRAK012530、MRAK132628、MRAK003448、XR_00645）實時熒光定量PCR檢測結果與基因芯片的結果相一致。
　　結論：LncRNAs在實驗性關節(jié)炎發(fā)病過程中存在差異表達，AST防治實驗性關節(jié)炎的機制可能與調

11、控差異表達的LncRNAs有關。
　　第二部分：基于LncRNA-miRNA-mRNA共表達網絡篩選實驗性發(fā)病過程中關鍵LncRNAs
　　目的：篩選實驗性關節(jié)炎發(fā)病過程中關鍵LncRNAs，探討其可能的發(fā)病機制。
　　方法：miRNAs基因表達譜數(shù)據(jù)來源于美國國立生物信息中心高通量基因表達數(shù)據(jù)庫和已發(fā)表文獻，LncRNAs/mRNAs基因表達譜數(shù)據(jù)來源于課題組前期已發(fā)表文章；以差異倍數(shù)>2和 P-value<0.05

12、為標準，篩選差異表達的LncRNAs、miRNAs和mRNAs；借助miranda和 targetscan預測差異miRNAs靶向的mRNAs，借助RNAhybrid預測差異miRNAs靶向的LncRNAs；將miRNAs靶向的LncRNAs和mRNAs，分別與差異LncRNAs和mRNAs合并，取交集，得到共表達LncRNAs和mRNAs；以共表達LncRNAs、mRNAs和差異miRNAs為基礎，構建LncRNA-miRNA-mRN

13、A共表達網絡，并進行功能信息學分析，篩選實驗性關節(jié)炎發(fā)病過程中關鍵LncRNAs。
　　結果：LncRNA-miRNA-mRNA共表達網絡由7個LncRNAs節(jié)點，24個miRNAs節(jié)點，90個mRNAs節(jié)點，301個邊緣組成；功能信息學分析結果表明，差異基因主要富集于147個GO條目，23條信號通路；LncRNA S56464.1, LncRNA XR_006437.1和LncRNA J01878被鑒定為實驗性關節(jié)炎發(fā)病過程中的

14、關鍵基因。
　　結論：LncRNAs在實驗性關節(jié)炎發(fā)病過程中具有重要的調節(jié)作用，LncRNA S56464.1, LncRNA XR_006437.1和LncRNA J01878可作為其潛在的診斷生物標志物和治療靶點。
　　第三部分：LncRNA S56464.1靶向miR-152/Wnt通路誘導FLS增殖及黃芪總皂苷干預作用
　　目的：明確LncRNA S56464.1通過靶向miR-152/Wnt通路誘導滑膜細胞的

15、增殖作用，探討黃芪總皂苷治療實驗性關節(jié)炎的可能機制。
　　方法：組織塊移植法分離、培養(yǎng)AA大鼠滑膜細胞，給予LncRNA S56464.1 siRNA和/或黃芪總皂苷干預，MTT法檢測成纖維樣滑膜細胞（fibroblast-like synoviocyte, FLS）的增殖反應；RT-qPCR技術檢測 LncRNA S56464.1干擾和/或 AST作用下 LncRNA S56464.1、miR-152、β-連環(huán)蛋白（β-cate

16、nin）、原癌基因C-myc、細胞周期蛋白（Cyclin） D1、糖原合成激酶（GSK）-3β和分泌型卷曲相關蛋白（SFRP）4 mRNA表達變化；免疫熒光和Western Blot技術檢測β-catenin、C-myc、Cyclin D1、GSK-3β、p-GSK-3β(Ser9)和SFRP4蛋白表達變化。
　　結果：與模型組相比，LncRNA S6464.1干擾組和/或黃芪總皂苷組，不僅可明顯抑制AA大鼠成纖維樣滑膜細胞的增殖

17、反應，還可顯著降低LncRNA56464.1、β-catenin、C-myc、Cyclin D1 mRNA，明顯抑制β-catenin、C-myc、Cyclin D1和p-GSK-3β(Ser9)/GSK-3β蛋白表達水平，升高miR-152和SFRP4 mRNA和/或蛋白表達水平。
　　結論：黃芪總皂苷對實驗性關節(jié)炎具有一定的治療作用，其機制可能與下調 LncRNA S56464.1表達，調控miR-152/Wnt信號通路，抑制