人參皂苷Rg1防治兔膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的
　　本實(shí)驗(yàn)以“補(bǔ)元”思想理論為指導(dǎo)，從“治未病”理念出發(fā)，分別從細(xì)胞因子含量變化、關(guān)節(jié)形態(tài)學(xué)改變、軟骨細(xì)胞增殖與凋亡四個方面、不同角度與層次研究補(bǔ)元要藥人參的有效成分人參皂苷 Rg1對兔膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的防治作用，為中醫(yī)藥防治骨性關(guān)節(jié)炎提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)研究依據(jù)。
　　方法
　　50只健康普通級新西蘭雄性大白兔，分成正常組、模型組、人參皂苷Rg1低、中、高劑量組，每組10只。除正常組外，其余4組兔采用左后肢管型石膏伸

2、直位固定法制備兔膝骨性關(guān)節(jié)炎模型。從造模第2天開始進(jìn)行藥物干預(yù)。人參皂苷 Rg1低、中、高劑量組分別給予人參皂苷 Rg15mg/kg、10mg/kg、20mg/kg灌胃給藥，正常組及模型組予以等劑量生理鹽水（5mL/kg）灌胃，每周3次，共6周。
　　1.炎性細(xì)胞因子檢測：各組分別于造模前及干預(yù)結(jié)束后，在嚴(yán)格無菌操作條件下行左膝關(guān)節(jié)穿刺，注入生理鹽水1ml、反復(fù)抽吸多次使沖洗液混勻后抽取關(guān)節(jié)液，測定干預(yù)前后關(guān)節(jié)液中重要致炎因子白細(xì)

3、胞介素1(IL-1)、一氧化氮（NO）、腫瘤壞死因子α(TNF-α)的含量變化。
　　2.細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察：干預(yù)結(jié)束后在麻醉下用空氣栓塞法處死所有實(shí)驗(yàn)兔，分別從大體肉眼觀、光鏡及透射電鏡(TEM)等方面,觀察各組兔膝關(guān)節(jié)組織形態(tài)學(xué)改變及超微結(jié)構(gòu)變化，并對觀察結(jié)果進(jìn)行Mankin評分。
　　3.軟骨細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：取負(fù)重面關(guān)節(jié)軟骨，采用RT-PCR技術(shù)檢測軟骨細(xì)胞增殖周期關(guān)鍵調(diào)控因子Cyclin D1、P21 mRNA表達(dá)情況；W

4、estern-blot技術(shù)檢測Cyclin D1、P21蛋白表達(dá)情況；增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)檢測及細(xì)胞增殖指數(shù)(PI)分析軟骨細(xì)胞增殖活性，以研究人參皂苷Rg1對軟骨細(xì)胞增殖的影響。
　　4.軟骨細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)：取負(fù)重面關(guān)節(jié)軟骨，采用RT-PCR技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡關(guān)鍵調(diào)控因子Caspase-3、Bax/bcl-2 mRNA表達(dá)情況;Western-blot技術(shù)檢測Caspase-3、Bax/bcl-2蛋白表達(dá)情況，原位末端標(biāo)記法（

5、Tunel）觀察軟骨細(xì)胞凋亡率，以研究人參皂苷Rg1對軟骨細(xì)胞凋亡的影響。
　　結(jié)果
　　1.炎性細(xì)胞因子含量變化：干預(yù)前各組關(guān)節(jié)液內(nèi) NO、IL-1、TNF-α含量無明顯差異(P>0.05)，干預(yù)結(jié)束后模型組關(guān)節(jié)液內(nèi) NO、IL-1、TNF-α含量較干預(yù)前顯著提高(P<0.01)；人參皂苷Rg1低、中、高劑量組NO、IL-1、TNF-α含量明顯低于模型組，差異有明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，且人參皂苷Rg1中、高劑量組N

6、O、IL-1、TNF-α含量低于人參皂苷Rg1低劑量組（P<0.05或P<0.01）。人參皂苷Rg1中、高劑量組相比，NO、IL-1、TNF-α含量差別無明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
　　2.組織形態(tài)學(xué)變化：大體肉眼觀：正常組關(guān)節(jié)軟骨表面整齊光滑有彈性，無軟化及缺損；模型組關(guān)節(jié)軟骨呈灰黃色,磨損嚴(yán)重，彈性差,局部出現(xiàn)潰瘍，滑膜大量增生；人參皂苷Rg1低劑量組關(guān)節(jié)軟骨呈黃色，關(guān)節(jié)表面略顯粗糙，無軟骨缺損，滑膜少量增生；人參皂苷R

7、g1中、高劑量組關(guān)節(jié)軟骨表面尚光滑，無軟骨缺損。光鏡觀察：正常組關(guān)節(jié)軟骨表面光滑，四層結(jié)構(gòu)清晰有序，潮線完整；模型組關(guān)節(jié)軟骨層變薄，軟骨細(xì)胞數(shù)量減少，形態(tài)發(fā)生改變，排列混亂，裂隙深達(dá)輻射層，潮線破壞，番紅O染色重度減弱；人參皂苷Rg1低劑量組關(guān)節(jié)軟骨層次基本完整,局部有表淺裂隙，潮線尚完整，番紅O染色輕、中度減弱；人參皂苷Rg1中、高劑量組關(guān)節(jié)軟骨層次完整,軟骨表面尚光滑,排列輕度紊亂，潮線完整，番紅 O染色輕度減弱。Mankin評分：

8、模型組評分最高，其余各組與模型組比較,差異有顯著性意義(P<0.01),人參皂苷Rg1中、高劑量組Mankin評分低于人參皂苷Rg1低劑量組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),但中、高劑量組兩組間比較差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。電鏡觀察：模型組軟骨細(xì)胞輪廓不清，外形不規(guī)則,細(xì)胞器腫脹甚至消失，核固縮，染色質(zhì)邊聚，甚至出現(xiàn)核分裂，凋亡小體形成；人參皂苷Rg1低劑量組軟骨細(xì)胞輕度萎縮,輪廓尚清晰，胞漿內(nèi)細(xì)胞器輕度腫脹，胞核完整,核膜稍

9、內(nèi)陷,染色質(zhì)分布輕度邊聚；人參皂苷Rg1中、高劑量組軟骨細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)接近于正常組。
　　3.軟骨細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：人參皂苷Rg1低、中、高劑量組P21 mRNA及相應(yīng)蛋白的表達(dá)均低于模型組（P<0.05或P<0.01），而CyclinD1 mRNA及相應(yīng)蛋白的表達(dá)高于模型組（P<0.05或P<0.01），PCNA檢測顯示人參皂苷Rg1低、中、高劑量組軟骨細(xì)胞增殖率明顯高于模型組（P<0.01）。各項(xiàng)指標(biāo)中以中劑量組效果最佳。
　

10、　4.軟骨細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)：模型組Bax、Caspase-3 mRNA及蛋白表達(dá)明顯高于正常組(P<0.01)及人參皂苷Rg1低、中、高劑量組(P<0.05或P<0.01)；模型組 Bcl-2 mRNA及蛋白表達(dá)明顯低于正常組(P<0.01)及人參皂苷 Rg1低、中、高劑量組(P<0.05或 P<0.01)。Tunel法檢測顯示，低、中、高劑量組凋亡率顯著低于模型組（P<0.01）；中、高劑量組凋亡率無顯著差別(P>0.05)，但低于低劑量

11、組（P<0.05或P<0.01）。各項(xiàng)指標(biāo)中以中劑量組效果最佳。
　　結(jié)論
　　1.伸直位管型石膏固定法造模6周，可成功建立類似臨床所見的人類骨關(guān)節(jié)炎模型。
　　2.一定劑量人參皂苷Rg1可有效減少關(guān)節(jié)液中炎性細(xì)胞因子NO、IL-1、TNF-α的含量，減輕關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)，改善關(guān)節(jié)內(nèi)微環(huán)境。
　　3.一定劑量人參皂苷Rg1可有效提高軟骨細(xì)胞G1期關(guān)鍵正向調(diào)節(jié)蛋白CyclinDl的表達(dá),抑制負(fù)向調(diào)控因子 P21表達(dá),推