復元膠囊對實驗性骨關節(jié)炎的軟骨保護作用研究.pdf

1、目的： 觀察中藥復方制劑-復元膠囊(簡稱FYC)對兔膝骨關節(jié)炎(OA)模型關節(jié)軟骨的組織形態(tài)學及MMP-13、TIMP-1、TIMP-2、IL-1β、TGF-β2表達的影響；研究FYC含藥血清對軟骨細胞增殖和P38信號通路的干預作用，探討FYC對骨關節(jié)炎軟骨退變的防治作用及可能的作用機理。 方法： 1．選用健康新西蘭大白兔66只，用改良Hulth法制備兔膝骨關節(jié)炎模型，以FYC灌胃為干預治療手段，觀察各組股骨內(nèi)髁

2、關節(jié)軟骨大體、光鏡和電鏡下的病理變化。采用免疫組化法檢測退變膝關節(jié)軟骨MMP-13、TIMP-2、IL-1β及TGF-β2的蛋白質(zhì)水平，RT-PCR法檢測MMP-13、TIMP-1、TIMP-2mRNA的表達。從骨關節(jié)炎軟骨的破壞因素和保護因素，從mRNA轉(zhuǎn)錄水平到蛋白質(zhì)表達水平，多層次、多角度觀察FYC對骨關節(jié)炎軟骨退變的影響。 2．選用健康21-28d齡SD大鼠，用酶消化法原代培養(yǎng)軟骨細胞，給予不同濃度的FYC含藥血清(0％

3、、5％、10％、20％)刺激第3代軟骨細胞，作用時間分別為24h、48h、72h，采用MTT法檢測FYC含藥血清對軟骨細胞的增殖，根據(jù)OD值選擇FYC含藥血清的最佳作用濃度和最佳作用時間納入后續(xù)試驗。細胞化學免疫法檢測Ⅱ型膠原表達以鑒定軟骨細胞。采用Western blot法研究FYC含藥血清對軟骨細胞中p-p38和MMP-13表達的干預作用，從信號通路的途徑，探討 FYC防治骨關節(jié)炎軟骨退變的可能作用機制。 結(jié)果：

4、 1．FYC對兔膝OA組織形態(tài)學的影響 正常組股骨髁關節(jié)軟骨光滑如常，改良Hulth術后4W時出現(xiàn)股骨內(nèi)髁軟骨面糜爛，骨贅形成，軟骨細胞器腫脹或破裂，核染色質(zhì)凝集等一系列OA的病理改變。術后8、12W時上述病理改變隨造模時間的延長而加重，大體評分和Mankin’s評分與正常組比較有顯著差異(p<0.05)。12W時FYC中、高劑量組能明顯抑制兔膝OA的軟骨退變，低劑量組以及4、8W時中、高劑量組均不能阻止軟骨形態(tài)學改變。

5、 2．FYC對兔膝OA軟骨中MMP-13、TIMP-2、IL-1β和TGF-β2的影響 免疫組化顯示：模型組全層軟骨胞漿中均有MMP-13表達，染色呈深棕色，4W時模型組MMP-13比正常組明顯升高，兩組間有顯著差異(p<0.01)。模型組8W時與4W時比較反而有所下降。8、12W時FYC中、高劑量組陽性細胞數(shù)目少，淺染，細胞分數(shù)與模型組比較有顯著差異(p<0.01)。 4、8、12W時FYC高劑量組TIMP-2

6、陽性細胞數(shù)比模型組多，染色深，其細胞分數(shù)與模型組比較有顯著差異(p<0.05)。8W時FYC中劑量組細胞分數(shù)與模型組比較有顯著差異(p<0.05)。 4、8、12W時模型組全層軟骨胞漿中均有IL-1β表達，為深棕褐色。4W時FYC低、中、高劑量組IL-1β細胞分數(shù)均低于模型組(p<0.05)，組間無明顯差異；8W時FYC中、高劑量組IL-1β細胞分數(shù)均低于模型組，與模型組比較皆有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；12W時FYC中、高劑

7、量組與模型組比較有顯著差異(p<0.01)，并隨劑量增加而顯著下降。 正常組全層軟骨細胞胞漿中均有TGF-β2陽性表達。4W時模型組關節(jié)軟骨陽性細胞減少，12W時陽性細胞更少，4、8、12W時模型組與正常組間比較有顯著差異(P<0.05)。4W時FYC中、高劑量組的表達同低劑量組比較，無明顯差異(p>0.05)；8、12W時FYC中、高劑量組TGF-β2的細胞分數(shù)與模型組比較有顯著差異(P<0.05)。 3．FYC對兔膝OA軟

8、骨中MMP-13、TIMP-1、TIMP-2mRNA表達的影響 4W時正常組關節(jié)軟骨MMP-13mRNA中等量表達(0.98±0.23)，隨時間延長變化不大。4W時模型組MMP-13mRNA的水平明顯增高(1.32±0.11)，8、12W時模型組比4W時模型組有所下降。4、12W時FYC低、中劑量組與模型組比較無統(tǒng)計學意義(p>0.05)；8W時低、中劑量組(0.96±0.03，0.94±0.04)與模型組(1.24±0.06)

9、比較有顯著差異(p<0.05)；4W時FYC高劑量組與模型組比較無統(tǒng)計學意義(p>0.05)；8、12W時FYC高劑量組MMP-13mRNA水平明顯降低(0.70±0.01，0.51±0.02)，與模型組比較有顯著差異(p<0.05)。 4W時正常組軟骨TIMP-1mRNA的表達較多(2.86±0.65)，隨時間延長變化不大。4W時模型組表達與正常組比較變化不大，8、12W時模型組表達明顯減少，與正常組比較有統(tǒng)計學意義(p<0.

10、05)。8、12W時FYC高劑量組TIMP-1mRNA的表達高于四環(huán)素組。12W時FYC中劑量組和8、12W時FYC高劑量組TIMP-1mRNA的表達比模型組增加，差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。 4W時正常組軟骨TIMP-2 mRNA表達較多(0.89±0.2)，隨時間延長變化不大。4、8、12W時模型組表達明顯降低，與正常組比較有顯著差異(p<0.05)。8W時FYC高劑量組和12W時FYC中、高劑量組TIMP-2mRN

11、A的表達比模型組增加，差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。試驗結(jié)果還發(fā)現(xiàn)TIMP-1與TIMP-2的變化不一致。 4．FYC含藥血清對軟骨細胞增殖的影響 48h時結(jié)果顯示，5％、10％、20％FYC含藥血清對軟骨細胞的增殖有促進作用，無遞增效應。10％、20％FYC含藥血清與5％空白血清組比較，有顯著差異(p<0.05)；5％FYC含藥血清組與5％空白血清組比較無明顯差異(p>0.05)。72h時結(jié)果顯示，5％、10％、

12、20％FYC含藥血清對軟骨細胞增殖也有促進作用，但不及48h時的作用佳。同時也發(fā)現(xiàn)48h和72h時的10％FYC含藥血清組作用強于20％FYC含藥血清組。MTT法顯示：10％FYC含藥血清組在48h時，10ng/mlIL-1β對軟骨細胞增殖的抑制作用最強。 5．FYC含藥血清對軟骨細胞p38信號通路的影響 FYC含藥血清能夠抑制p-p38蛋白在軟骨細胞中的表達。10％FYC組與10％空白血清組比較差異顯著(p<0.05)

13、。在IL-1β的刺激下，10％空白血清+IL-1β組和10％FYC+IL-1β組比較有顯著差異(p<0.05)。 FYC含藥血清能夠抑制MMP-13在軟骨細胞中的表達。MMP-13在10％空白血清組和10％FYC組的表達較正常組明顯增加，10％FYC組與10％空白血清組比較有明顯差異(p<0.01)。FYC抑制IL-1β信號轉(zhuǎn)導通路上的p-p38的表達，但抑制P38MAPK通路后，MMP-13的表達并未減少。 結(jié)論：

14、 1．FYC對Hulth模型所致的骨關節(jié)炎軟骨損傷有明顯的保護作用。通過FYC不同劑量組、四環(huán)素組與模型組在關節(jié)軟骨的外觀、組織學評分、軟骨組織超微結(jié)構(gòu)的比較，表明FYC能降低軟骨損傷的組織學評分，減緩膠原降解、抑制軟骨退變。以8、12周時中、高劑量組的療效最為明顯。 2．FYC能抑制兔膝OA關節(jié)軟骨MMP-13的活化，促進TIMP1、TIMP-2的生成，調(diào)節(jié)MMPs/TIMPs的平衡。 3．FYC能抑制兔膝OA關節(jié)