HHV6、HPV16、HSV在局灶性皮質(zhì)發(fā)育障礙中的表達(dá).pdf

1、研究背景和目的:
　　皮質(zhì)發(fā)育障礙（malformations of cortical development，MCD）又稱作皮質(zhì)發(fā)育不良、皮質(zhì)發(fā)育畸形[1]等，是一組局灶性或彌漫性皮質(zhì)結(jié)構(gòu)異常病變的總稱[2]。常引起癲癇、發(fā)育遲緩、局部神經(jīng)功能障礙和精神發(fā)育不全等多種臨床表現(xiàn)。由于皮質(zhì)組建異常，離子通道病變(channelopathies)等，常引起異常神經(jīng)元電位形成，神經(jīng)元興奮-抑制失衡的興奮毒性作用，是觸發(fā)癲癇的重要病理生理

2、機(jī)制。占癲癇病因的24％，占耐藥性癲癇大約40％，是難治性癲癇的主要病因。
　　局灶性皮質(zhì)發(fā)育障礙(focal cortical dysplasia，F(xiàn)CD)是MCD的重要亞型之一，1971年由泰勒及其同事[3]首先發(fā)現(xiàn)并詳細(xì)描述。FCD是難治性癲癇的重要病因，也是癲癇手術(shù)中最常見的皮質(zhì)發(fā)育障礙類型[4]。FCD主要影響大腦皮質(zhì)區(qū)域，以皮質(zhì)分層異常和異形細(xì)胞為特點(diǎn)，并據(jù)此分為三型(FCDⅠ，F(xiàn)CDⅡ，F(xiàn)CDⅢ)，其中，F(xiàn)CDⅡ是最

3、重要的亞型，出現(xiàn)特征性的異形神經(jīng)元(FCDⅡa)和氣球樣細(xì)胞(FCDⅡb)，與藥物難治性癲癇關(guān)系尤為密切[4]。
　　FCD作為難治性癲癇最重要的病因，其具體的形成機(jī)制仍不清楚。目前，有報(bào)道表明，哺乳動物類雷帕霉素靶蛋白受體(mTOR)信號途徑的破壞可導(dǎo)致FCD的異常組織結(jié)構(gòu)。其他機(jī)制，比如胚胎期的基因突變及外部環(huán)境誘導(dǎo)的損傷（病毒感染，局部缺血或缺氧等）也被認(rèn)為是誘導(dǎo)FCD的主要病因[5]?；蛲蛔円呀?jīng)被臨床樣本及動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)[

4、5,6]。外部環(huán)境誘導(dǎo)的損傷，比如致畸性化學(xué)試劑，外傷等也已通過動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)[6，7]。然而，病毒感染在FCD中的作用尚不清楚。
　　已有大量研究顯示，病毒感染及其誘發(fā)的炎癥反應(yīng)是癲癇發(fā)病的重要原因，病毒感染可引起臨床癲癇發(fā)作，利用病毒感染可建立癲癇發(fā)作模型。同時(shí)，胚胎期病毒感染及其誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)尚可通過NFκB和mTOR等信號的激活，影響神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、遷移和分化，導(dǎo)致腦發(fā)育異常形成FCD。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，胚胎期易感病毒，如單純皰疹

5、病毒(Herpes simplex virus，HSV)，人乳頭瘤病毒16(Human papillomavirus16，HPV16)，人皰疹病毒6(Human herpesvirus6，HHV6)在癲癇患者的腦組織中檢出率也明顯高于正常人，進(jìn)一步支持胚胎期病毒感染可能是FCD形成和癲癇發(fā)生的重要原因，但病毒感染在臨床FCD手術(shù)切除標(biāo)本尚未證實(shí)。因此，本課題將檢測胚胎期易感病毒在FCD的表達(dá)，探討FCD癲癇和胚胎期易感病毒的相關(guān)關(guān)系，為

6、臨床上治療FCD癲癇提供新的思路。
　　方法:
　　1.收集不同病人的腦組織切除標(biāo)本（包括FCDⅡa、FCDⅡb以及對照）。
　　2.提取上述病人腦組織DNA，采用Nested-PCR技術(shù)，檢測標(biāo)本中HSV1，HSV2，HHV6A，HHV6B，HPV16的感染情況。
　　3.選取Nested-PCR陽性結(jié)果作為實(shí)驗(yàn)組，以正常腦組織作為對照組，采用免疫組化、免疫熒光的方法驗(yàn)證Nested-PCR的結(jié)果，并觀察病毒感

7、染的形態(tài)學(xué)分布。
　　4.用Western Blot進(jìn)一步驗(yàn)證之前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
　　5.以上述結(jié)果中感染病毒的標(biāo)本作為實(shí)驗(yàn)組提取RNA，以無病毒感染的正常人大腦皮層提RNA作為對照組。采用RT-PCR技術(shù)檢測病毒感染后下游信號TLR3及TRIF的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.成功收集實(shí)驗(yàn)組（FCD組）標(biāo)本37例，對照組標(biāo)本22例。根據(jù)臨床及病理分型結(jié)果，實(shí)驗(yàn)組中:FCDⅡa20例，F(xiàn)CDⅡb17例;對照組中:外傷8

8、例、腦出血4例，其他腫瘤周圍正常組織10例。
　　2.Nested-PCR檢測HHV6A在FCD組的感染率為20/37(54.1％)，其中，F(xiàn)CDⅡa感染率為9/20(45.0％)，F(xiàn)CDⅡb感染率為11/17(64.7％)，對照組感染率為2/22(9.1％)（與FCD組比較存在顯著差異，P＜0.05）;HHV6B在FCD組的感染率為25/37(67.6％)，其中，F(xiàn)CDⅡa感染率為14/20(70.0％)，F(xiàn)CDⅡb感染率為11

9、/17(64.7％)，對照組感染率為5/22(22.7％)（與FCD組比較存在顯著差異，P＜0.05）;基因測序、免疫組化和Western Blot檢測證實(shí)了HHV6A和HHV6B病毒及其表達(dá)產(chǎn)物的存在。
　　3.Nested-PCR檢測HPV16在FCD組的感染率為18/37(48.6％)，其中，F(xiàn)CDⅡa感染率為9/20(45.0％)，F(xiàn)CDⅡb感染率為9/17(52.9％)，對照組感染率為4/22(18.2％)（與FCD組比

10、較存在顯著差異，P＜0.05）;免疫組化和Westem Blot檢測證實(shí)了HPV16病毒表達(dá)產(chǎn)物的存在。
　　4.Nested-PCR檢測HSV1在FCD組的感染率為33/37(89.2％)，其中，F(xiàn)CDⅡa感染率為18/20(90.0％)，F(xiàn)CDⅡb感染率為15/17(88.2％)，對照組感染率為5/22(22.7％)（與FCD組比較存在顯著差異，P＜0.05）;HSV2在FCD組的感染率為30/37(81.1％)，其中，F(xiàn)CD

11、Ⅱa感染率為16/20(80.0％)，F(xiàn)CDⅡb感染率為14/17(82.4％)，對照組感染率為2/22(9.1％)（與FCD組比較存在顯著差異，P＜0.05）;免疫組化和Western Blot檢測證實(shí)了上述HSV1和HSV2病毒表達(dá)產(chǎn)物的存在。
　　5.在病毒感染陽性標(biāo)本中，下游信號分子TLR3及TRIF的表達(dá)水平明顯高于無病毒感染的對照組(TLR3:t=39.220，P=0.000; TRIF:t=22.226，p=0.00