強(qiáng)直性脊柱炎韌帶組織比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究及膜聯(lián)蛋白A2功能驗(yàn)證.pdf

1、強(qiáng)直性脊柱炎（Ankylosing spondylitis，AS）是一種以慢性炎癥和異常骨化為特征的自身免疫性疾病。世界范圍內(nèi)各個國家和種族基本都存在AS患者，而且AS病患人群數(shù)量龐大。我國AS患病率約0.3％，鑒于我國巨大的人口基數(shù)，AS病人數(shù)量接近400萬;AS臨床特征表現(xiàn)為慢性炎癥反應(yīng)和新骨形成、異常骨化。AS致殘率很高，病人在長期遭受背痛、腰痛、關(guān)節(jié)痛的折磨后，人體的中軸骨和四肢關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)進(jìn)行性破壞，最終出現(xiàn)關(guān)節(jié)骨性僵直，進(jìn)而導(dǎo)致

2、頸部、腰部和下肢行動能力的減弱，甚至完全喪失活動能力。其中，AS患者中有73％會出現(xiàn)外周關(guān)節(jié)受累，其中髖關(guān)節(jié)韌帶骨化發(fā)生率為25％-50％，而這些患者中有50％-90％會累及雙側(cè)髖關(guān)節(jié)。除此之外，AS伴發(fā)全身性并發(fā)癥，可累及眼睛、腸道、肺、腎、心臟、血管、皮膚、骨和中樞神經(jīng)等多個重要組織和器官。目前，AS的治療僅能做到緩解炎癥反應(yīng)，但是緩解的機(jī)理尚不清除。對于新骨形成、異常骨化尚無任何治療手段。因此，對于AS這種疾病需要進(jìn)一步去了解，需

3、要采取更多的研究手段加深認(rèn)識。
　　近年來蛋白質(zhì)組學(xué)已成為生命科學(xué)的前沿領(lǐng)域之一。蛋白質(zhì)組學(xué)是采用大量精密的數(shù)據(jù)分析手段，以功能譜和表達(dá)譜的形式表現(xiàn)有機(jī)體的本質(zhì)，以達(dá)到所有的蛋白基因表達(dá)的研究。采用2D-Nano-LC-ESI-MS/MS蛋白組學(xué)研究技術(shù)，可以大大提高差異蛋白質(zhì)的檢出率，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)的固相2D蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法，現(xiàn)在已經(jīng)成為最新的蛋白質(zhì)組學(xué)研究手段。國際上對AS的蛋白質(zhì)組學(xué)研究現(xiàn)在只處在初步階段，僅有幾篇以血液細(xì)胞

4、為實(shí)驗(yàn)材料的報道。強(qiáng)直性脊柱炎(AS)的蛋白質(zhì)組學(xué)分析比較患者與對照韌帶成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞的蛋白表達(dá)差異，闡明強(qiáng)直性脊柱炎(AS)的發(fā)病機(jī)制是本課題的研究目的。
　　第一章 強(qiáng)直性脊柱炎韌帶組織比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究
　　利用晚期發(fā)生韌帶骨化或具有骨化傾向的AS患者的病變韌帶組織和正常人韌帶組織，首先進(jìn)行原代成纖維細(xì)胞培養(yǎng)，獲得了35例AS樣本，10例正常對照樣本。再采用shot-gun法lable-free方式進(jìn)行強(qiáng)直性脊柱炎韌

5、帶成纖維細(xì)胞的比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究，尋找存在于AS患者及正常人的韌帶組織中的差異表達(dá)蛋白。利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，對正常人和患者的蛋白質(zhì)組進(jìn)行比較分析，以找出該疾病的特異性蛋白分子，先通過二維液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)對樣品中的所有蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，Deltavue軟件被用來確定疾病組和正常對照組蛋白表達(dá)的“質(zhì)量”（乙酰化和磷酸化修飾）和“量”（表達(dá)）的差異，然后不同的手段，例如質(zhì)譜鑒定或者是氨基酸序列的推測及構(gòu)建，以達(dá)到確定蛋白質(zhì)的目的，利用生物信息

6、學(xué)方法預(yù)測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和可能的功能篩選候選基因;發(fā)現(xiàn)β脂肪酸氧化通路中的6個蛋白上調(diào)顯著(HADHB，ECHS1，ACSL4，ACADM，ACSL1和HADH)而INSR通路(INSR，IRS1，PI3K和PKC)蛋白卻下調(diào)表達(dá)。其次，通過聚合酶鏈反應(yīng)、蛋白印跡和質(zhì)譜等技術(shù)對這些蛋白的表達(dá)進(jìn)行了驗(yàn)證。同時，結(jié)合臨床數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，AS患者BMI和BMIZ評分顯著低于正常人。以上這些結(jié)果提示β脂肪酸氧化通路減少了AS患者體內(nèi)的脂肪儲備，這一點(diǎn)首次

7、通過基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明。
　　第二章 膜聯(lián)蛋白A2在強(qiáng)直性脊柱炎致病過程中的功能研究
　　強(qiáng)直性脊柱炎在結(jié)構(gòu)上主要是由于新骨的形成而導(dǎo)致結(jié)構(gòu)損傷，進(jìn)而使得中軸骨發(fā)生骨化強(qiáng)直。骨組織發(fā)育需要多種因子共同參與的過程，這些因子包括Osterix蛋白(OSX)、runt相關(guān)基因2(Runx2)、轉(zhuǎn)化生長因子p、骨鈣素(OCN)、堿性磷酸酶(ALP)以及骨形成蛋白2(BMP2)等。調(diào)控破骨細(xì)胞分化的細(xì)胞因子主要包括:骨保護(hù)素(osteo

8、protegerin，OPG)、核因子κB受體活化因子(receptoractivator of nuclearfactor-kappa B，RANK)及核因子κB受體活化因子配體(receptoractivator of nuclearfactor-kappa B ligand, RANKL)。
　　目前，對于強(qiáng)直性脊柱炎的體外模型，報道較少，我們以Annexin A2的高表達(dá)為指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)IL-6誘導(dǎo)原代的韌帶成纖維細(xì)胞，可以升

9、高Annexin A2，因此采用此種模型進(jìn)行Annexin A2功能考察。我們用A2蛋白干擾序列轉(zhuǎn)染方法和雜交Westem檢測方法，考察了BMP2、OCN、OPG、OSX、ERK1/2、RANK以及RANKL的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Annexin A2干擾序列能夠抑制BMP2、OCN、OPG、OSX的高表達(dá)以及ERK1/2磷酸，同時還能夠促進(jìn)RANK、RANKL的表達(dá)，因此我們推測AnnexinA2干擾序列對于強(qiáng)直性脊柱炎的影響，一方面可以

10、通過抑制的ERK1/2的磷酸化達(dá)到控制炎癥的作用;另一方面可以通過對骨形成因子(BMP2、OCN、OPG、OSX)的調(diào)節(jié)，達(dá)到抑制新骨形成的作用;同時Annexin A2干擾序列還能夠提高破骨細(xì)胞因子RANK、RANKL的表達(dá)，促進(jìn)破骨細(xì)胞的生成，從而抑制破骨細(xì)胞的增殖和分化。同時我們設(shè)計合成了Annexin A2過表達(dá)序列，考察了Annexin A2過表達(dá)序列對IL-6誘導(dǎo)原代的韌帶成纖維細(xì)胞的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞因子(BMP2、O

11、CN、OPG、OSX)高表達(dá)，同時還抑制了破骨細(xì)胞因子（RANK、RANKL）的表達(dá)，而在AnnexinA2過表達(dá)載體植入的原韌帶成纖維細(xì)胞中加入ERK1/2抑制，Western blot檢測發(fā)現(xiàn)與ERK1/2抑制相比，成骨細(xì)胞因子(BMP2、OCN、OPG、OSX)的表達(dá)有所升高，而破骨細(xì)胞因子(RANK、RANKL)的表達(dá)有所降低。因此，這一結(jié)果提示我們AnnexinA2可能是通過ERK1/2信號通路來調(diào)控成骨細(xì)胞因子和破骨細(xì)胞因子