強直性脊柱炎的蛋白質組學研究.pdf

1、強直性脊柱炎(Ankylosing Spondylitis，AS)是常見的炎癥性系統(tǒng)性風濕病，其發(fā)病率及致殘率均較高，但至今其病因及發(fā)病機制研究尚未完全闡明，早期診斷尚存在較大困難，目前亦無理想的根治方法。因此，對AS的病因、發(fā)病機制、診斷指標、治療靶點和治療相關藥物的進一步研究，以加強對AS疾病的了解和認識，使AS患者在疾病早期能得到正確的診斷和有效治療，對于改善AS患者預后、提高國民健康素質均有重要意義。蛋白質組學研究具有高通量、高

2、靈敏度和高精確度等優(yōu)點，有關AS患者蛋白質組差異表達情況至今尚罕有報道，本研究擬探討AS患者蛋白質組差異表達情況，為以后AS的發(fā)病機制、早期診斷和治療提供理論依據和重要的研究線索。
　　 第一部分
　　 強直性脊柱炎患者外周血單個核細胞的蛋白質組學研究
　　 目的:
　　 應用蛋白質組學雙向凝膠電泳和質譜技術尋找并鑒定AS患者、RA患者與健康志愿者(Healthy Volunteer，HV)之間外周血單個

3、核細胞(PBMCs)的差異表達蛋白，再挑選部分在AS中有顯著差異表達的蛋白采用Western-blot和/或實時熒光定量RT-PCR方法擴大樣本量進行驗證，尋找AS的疾病相關蛋白，為AS的發(fā)病機制、診斷、鑒別診斷以及治療提供新的理論依據和研究線索。
　　 材料與方法:
　　 1.分別收集年齡與性別相互匹配的AS患者、HV和RA患者EDTA抗凝血各6例。分離PBMCs并提取總蛋白后分別進行雙向凝膠電泳。凝膠圖譜經PDQue

4、st軟件分析后找出組間表達差異至少達5倍的蛋白質點行基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)或MALDI-TOF-TOF-MS分析獲得肽質量指紋圖譜(PMF)或肽序列標簽(PST)，然后利用Mascot搜索引擎搜索Swiss-Prot數(shù)據庫鑒定蛋白質。
　　 2.將研究樣本擴大到每組32例，從鑒定出的在AS患者有顯著差異表達的蛋白中挑選Talin1和Integrin-Iinked kinase以Western

5、-blot方法進行驗證，并進一步采用實時熒光定量RT-PCR對Talin1 mRNA進行檢測，以驗證雙向電泳發(fā)現(xiàn)的差異蛋白質表達結果。
　　 結果:
　　 1.成功建立了重復性好、分辨率高的PBMCs蛋白質組雙向凝膠電泳圖譜。軟件分析后得到10個在AS組中高表達的差異蛋白質點，經質譜分析成功鑒定出6個蛋白，分別為丙酮酸激酶(Pyruvate Kinase，PK)、肌動蛋白抑制蛋白1(Profilin1，PFN1)、踝蛋白

6、1(Talin1，TLNl)、親環(huán)素A(Cyclophilin A，CYPA)A鏈、未知蛋白(gi|16306948)和整合素連接激酶(Integrin-IinkedKinase，ILK)。
　　 2.Western-blot結果提示，經內參校正后的TLN1在AS、HV及RA組分別為1.1411±0.4292、0.4686±0.2139和0.3805±0.1590，而ILK則分別為1.1201±0.2705、0.7404±0.2

7、310和0.7011±0.3794，TLN1及ILK在AS組的平均表達水平均明顯高于HV和RA組(P<0.05)； RA組患者TLN及ILK的平均表達水平較HV組稍低，但兩組間的差異并無顯著性(P>0.05)。
　　 3.實時熒光定量RT-PCR結果顯示，AS、HV及RA組TLN1 mRNA的水平分別為9.36±2.20、1.00±0.24和0.97±0.20，AS組明顯高于HV及RA組(P<0.05)，而RA組患者TLN1 m

8、RNA水平與HV組相近(P>0.05)。
　　 結論:
　　 1.雙向凝膠電泳結合質譜技術可成功建立PBMCs差異蛋白質組學研究方法，為尋找疾病相關蛋白質和疾病標志物的研究提供了有效手段。
　　 2.AS患者、健康志愿者和RA患者PBMCs蛋白表達譜間存在差異，PK、PFN1、TLN1、CYPAA鏈、ILK在AS患者中存在明顯而特異的表達增高。
　　 3.PK、PFN1、TLN1、CYPA A鏈及ILK可

9、能為AS的疾病相關蛋白，可作為AS潛在的疾病標志物行進一步研究，為AS的發(fā)病機制和血液學診斷指標的研究提供了重要線索。
　　 第二部分
　　 強直性脊柱炎患者血清蛋白質組學研究
　　 目的:
　　 應用蛋白質組學雙向凝膠電泳和質譜技術尋找并鑒定AS患者、RA患者與健康志愿者(Healthy Volunteer，HV)血清之間的差異表達蛋白，并挑選部分差異蛋白采用ELISA方法擴大樣本量進行驗證，尋找AS患

10、者血清中的疾病相關蛋白，為AS的發(fā)病機制、診斷、鑒別診斷以及治療提供新的理論依據和研究線索。
　　 材料與方法:
　　 1.分別收集年齡與性別相互匹配的AS患者、HV和RA患者血清各6例。采用混合上樣方法，經去除高峰度蛋白后分別進行雙向凝膠電泳。凝膠圖譜經PDQuest軟件分析后找出組間表達差異至少達5倍的蛋白質點行MALDI-TOF-MS或MALDI-TOF-TOF-MS分析獲得PMF或PST，然后利用Mascot搜索

11、引擎搜索Swiss-Prot數(shù)據庫鑒定蛋白質。
　　 2.將研究樣本擴大到每組32例，從鑒定的差異蛋白中挑選CP protein和transthyretin經ELISA進行檢測，以驗證雙向電泳發(fā)現(xiàn)的差異蛋白表達結果。
　　 結果:
　　 1.成功建立了重復性好、分辨率高的血清蛋白質組雙向凝膠電泳圖譜。軟件分析后得到13個在AS和/或RA組中存在異常表達的差異蛋白質點，經質譜分析鑒定出10個蛋白，其中plasma

12、glutathione peroxidase(GPx3)和similar tocomplement component3僅在AS組中表達降低，transthyretin(TTR)A鏈在AS及RA組表達均明顯下調，amyloid related serum protein SAA(SAA)、apolipoprotein A(ApoA)-IV、ApoA-IV precursor、haptoglobin Hp2(Hp2)、CP protein

13、和IGSF22 protein在AS及RA組表達均升高，而HT016僅在RA組表達增高。
　　 2.經ELISA檢測，CP在AS、HV及RA組分別為0.2963±0.0650、0.2035±0.0374和0.3295±0.1125 mg/ml，AS及RA組較HV組明顯升高(P<0.05)，而AS與RA組間差異無顯著性(P>0.05)；TTR在AS、HV及RA組分別為0.0993±0.0197、0.1544±0.0431和0.10

14、77±0.0219 mg/ml，AS與RA組較HV組有明顯降低(P<0.05)，而AS與RA組間差異無顯著性(P>0.05)。
　　 結論:
　　 1.經有效去除高豐度蛋白后，利用雙向凝膠電泳結合質譜技術可成功建立血清差異蛋白質組學研究方法，為尋找疾病相關蛋白和疾病標志物的研究提供了有效手段。
　　 2.AS患者、健康志愿者和RA患者血清蛋白表達譜間存在差異，GPx3和similar tocomplement c

15、omponent3在AS患者中存在特異的表達降低，而HT016僅在RA組高表達，因而這3個蛋白有可能為AS或RA潛在的血清疾病標志物，經進一步驗證后作為AS和RA早期診斷和鑒別診斷指標，也有可能作為AS或RA特異性藥物治療的研究靶點。
　　 3.TTR在AS與RA患者中表達均下降而SAA、ApoA-IV、ApoA-IV precursor、Hp2、CP protein及IGSF22 protein在AS與RA患者中表達均升高，這