節(jié)旋藻-螺旋藻基因組特性初探及硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因克隆與序列分析.pdf

1、節(jié)旋藻／螺旋藻(Arthrospria/SPirulina)因其重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和特殊的生物學(xué)性質(zhì)而受到廣泛關(guān)注。雖然其分子遺傳學(xué)研究開展較早，但與其它已測序模式藍(lán)藻集胞藻(Synechocystis)PCC 6803、聚球藻(Synechococcus sp．)WH 8120、魚腥藻(Anabaena)PCC 7120和念珠藻(Nostoc punctiforme)等相比，其研究進(jìn)展十分緩慢。目前已克隆并發(fā)表的節(jié)旋藻基因僅30多個(gè)，有關(guān)

2、節(jié)旋藻基因組學(xué)研究尚屬空白，對節(jié)旋藻基因組特性更加缺乏了解。本研究針對節(jié)旋藻自身結(jié)構(gòu)和成分上的特點(diǎn)，通過優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方法構(gòu)建了極大節(jié)旋藻(Arthrospria maxima．)FACHB438高分子量、高覆蓋率的基因組fosmid文 庫。該文庫含有4300個(gè)克隆，重組頻率是97.1[％]，插入片段平均大小為36.1kb，覆蓋了節(jié)旋藻基因組的27.9倍。高分子量、高覆蓋率節(jié)旋藻基因組文庫的構(gòu)建為物理圖譜的繪制及最終全基因組測序奠定基礎(chǔ)，同時(shí)

3、也為開展比較基因組學(xué)、基因定位克隆等研究奠定基礎(chǔ)。 以序列標(biāo)簽位點(diǎn)(STS)為路標(biāo)構(gòu)建重疊群圖譜是目前最普遍、最經(jīng)典、分辨率最高的物理作圖方法。本研究隨機(jī)挑選了100個(gè)克隆進(jìn)行雙末端測序，并挑選了14對特異性的STS序列設(shè)計(jì)引物，以1536個(gè)克隆為模板，根據(jù)STS-PCR反 應(yīng)池方案篩選了127個(gè)種子克隆，根據(jù)這些克隆之間的重疊位置關(guān)系拼接了4 個(gè)連續(xù)的重疊克隆群，為最終節(jié)旋藻物理圖譜的繪制奠定了基礎(chǔ)。 同時(shí)，又隨機(jī)挑選

4、了一些克隆進(jìn)行末端測序，共得到602個(gè)高質(zhì)量的序列。這些序列總長為307，547bp，覆蓋節(jié)旋藻基因組5.70[％]。序列相似性分析篩查到287條序列與已知功能的基因高度匹配，63條為假說蛋白(hypothetical protein)基因，另外發(fā)現(xiàn)了252條新基因，比例高達(dá)41.8[％]。密碼子和GC含量分析表明：極大節(jié)旋藻密碼子使用沒有明顯的偏倚性，密碼子第一、二、三位GC含量分別為46.9[％]，39.8[％]和45.5[％]，基

5、因組GC含量為43.6[％]；節(jié)旋藻基因組和編碼區(qū)的GC含量與絲狀藍(lán)藻魚腥藻PCC 7120和念珠藻(Nostoc punctiforme)相近，與單細(xì)胞的藍(lán)藻相差較大。對已知功能的基因進(jìn)行KEGG分類,共參與17種不同的代謝途徑,其中參與復(fù)制、修復(fù),信號轉(zhuǎn)導(dǎo),碳代謝等途徑的基因較多。同時(shí),發(fā)現(xiàn)有25個(gè)序列編碼來自于同一物種的反轉(zhuǎn)錄酶,進(jìn)一步分析表明它們屬于一個(gè)同源簇基因,推測該基因在節(jié)旋藻細(xì)胞中可能以高拷貝的形式存在,在節(jié)旋藻進(jìn)化及代

6、謝調(diào)控方面可能發(fā)揮重要作用。同時(shí)發(fā)現(xiàn)編碼二元信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)(two-component singal transdution,TCST)和ABC(ATP-binding cassette)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)基因家族元件的序列也相對較多。本研究又對節(jié)旋藻硝酸鹽/亞硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因進(jìn)行了克隆和序列分析,該基因長1515 bp,編碼504個(gè)氨基酸,其中疏水性氨基酸含量較高,達(dá)47.6[％],推測該序列含有12個(gè)跨膜α螺旋區(qū),同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了保守

7、的蛋白激酶C識別基序。該基因的密碼子存在明顯的簡并和偏倚特性;與其它六種藍(lán)藻以及鹽藻、萊茵衣藻和擬南芥進(jìn)行序列相似性分析,結(jié)果節(jié)旋藻與同屬顫藻門的束毛藻(Trichodesmium erythraeum)WH 9601相似性最高,達(dá)73.3[％],與集胞藻(Crocosphaera sp.)WH 8501和絲狀藍(lán)藻念珠藻(Nostoc.punctiforme)PCC 73102相似性次之,分別為65.9[％]和59.8[％]?；虻南到y(tǒng)