螺旋藻藻藍(lán)蛋白的自催化重組及藻藍(lán)膽素裂合酶功能比較研究.pdf

1、本論文以鈍頂螺旋藻(Sourμlina platensis FACHB314)基因組為模板克隆了藻藍(lán)蛋白α亞基基因cpcA以及催化脫輔基蛋白與色基結(jié)合的裂合酶基因cpcE和cpcF,連同鐵氧蛋白氧化還原酶基因pcyA和亞鐵血紅素氧化酶基因hoxl(模板為Synechocystis sp.PCC6803基因組DNA),在大腸桿菌體內(nèi)實(shí)現(xiàn)了利用螺旋藻自身裂合酶催化合成具有熒光活性的螺旋藻藻藍(lán)蛋白α亞基。在研究過(guò)程中同時(shí)發(fā)現(xiàn)藻藍(lán)蛋白α亞基可以

2、在沒(méi)有裂合酶的情況下與藻藍(lán)膽素自我催化結(jié)合,但是結(jié)合效率很低,其熒光強(qiáng)度僅為有裂合酶催化的藻藍(lán)蛋白的34％。
　　 克隆了鈍頂螺旋藻藻藍(lán)蛋白β亞基基因cpcB,以及聚球藻Synechococcus sp.PCC 7002的裂合酶基因cpcT、cpcU和cpcS(7002),集胞藻Synechocystis sp.PCC6803的裂合酶基因cpcS(6803)。通過(guò)構(gòu)建不同的表達(dá)菌株分別比較了裂合酶CpcT、CpcU、CpcS(7

3、002)、CpcU/CpeS(7002)、CpcS(6803)對(duì)螺旋藻藻藍(lán)蛋白β亞基的催化作用效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明CpcU/CpcS(7002)作為異源二聚體能夠有效的催化藻藍(lán)蛋白β亞基與藻藍(lán)膽素的結(jié)合,其表達(dá)菌株上清液的熒光強(qiáng)度為110.1;而CpcT的催化效率最低,其熒光強(qiáng)度僅為52.71;CpcS(6803)的催化效果居于二者之間,熒光強(qiáng)度為81.69。同時(shí)發(fā)現(xiàn)藻藍(lán)蛋白β亞基可以與藻藍(lán)膽素自主結(jié)合,而且自催化效率比較高,熒光強(qiáng)度與表

4、達(dá)菌株BUS(7002)的接近,為111.5。通過(guò)構(gòu)建表達(dá)菌株AUS(7002),發(fā)現(xiàn)聚球藻裂合酶CpcU/CpcS(7002)也可以催化藻藍(lán)蛋白α亞基與藻藍(lán)膽素PCB的結(jié)合,其熒光強(qiáng)度為無(wú)裂合酶催化的藻藍(lán)蛋白α亞基的1.8倍。
　　 克隆了鈍頂螺旋藻藻藍(lán)蛋白基基因cpcBA、ussBcpcBA,通過(guò)建立各種表達(dá)菌株比較了α和β亞基均存在的情況下以及帶有藻藍(lán)蛋白自身啟動(dòng)子的情況下,裂合酶CpcE/CpcF,CpcU/CpcS(7

5、002)對(duì)藻藍(lán)蛋白的催化效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明同時(shí)表達(dá)αβ亞基的表達(dá)菌株的蛋白合成效果比僅含有α亞基或β亞基的表達(dá)菌株的效果好。其中表達(dá)菌株uBA-EF的表達(dá)效果最好,其最大發(fā)射峰為640nm,最接近天然藻藍(lán)蛋白的最大發(fā)射峰(645nm),而且熒光強(qiáng)度最高(369.2)。因此推測(cè)可以參照表達(dá)菌株uBA-EF構(gòu)建水稻中有熒光活性的螺旋藻藻藍(lán)蛋白的表達(dá)體系。
　　 本文通過(guò)研究螺旋藻藻藍(lán)蛋白的自催化作用以及對(duì)不同藻藍(lán)蛋白裂合酶功能的比較