鈍頂節(jié)旋藻cpcB基因上游序列結(jié)構(gòu)功能的研究.pdf

1、以綠色熒光蛋白基因(gfp)為報(bào)告基因，構(gòu)建了由鈍頂節(jié)旋藻藻藍(lán)蛋白cpcB基因上游序列驅(qū)動(dòng)的綠色熒光蛋白表達(dá)載體，通過熒光顯微鏡檢測(cè)和流式細(xì)胞儀證明，GFP能夠在大腸桿菌中表達(dá)。SDS-PAGE分析表明，GFP在37℃條件下的表達(dá)水平約占菌體總蛋白的16％左右，推測(cè)在藻藍(lán)蛋白基因上游序列中可能存在較強(qiáng)的啟動(dòng)子元件。并且GFP在大腸桿菌中的表達(dá)受到培養(yǎng)溫度的影響，溫度越高，表達(dá)水平越高。對(duì)翻譯起始區(qū)(TIR)的軟件分析和突變分析顯示，一種

2、RNA的特殊二級(jí)結(jié)構(gòu)(RNA溫度計(jì))與溫度的影響有關(guān)，在鈍頂節(jié)旋藻藻藍(lán)蛋白cpcB基因的TIR中，可能也存在這種結(jié)構(gòu)。 啟動(dòng)子分析軟件預(yù)測(cè)顯示，在cpcB基因上游序列中存在6條啟動(dòng)子，并采用定點(diǎn)突變方法分離，實(shí)驗(yàn)證明每條啟動(dòng)子均能單獨(dú)控制GFP表達(dá)。通過流式細(xì)胞儀對(duì)GFP表達(dá)水平分析顯示，第三條啟動(dòng)子的強(qiáng)度最高，第四條次之。通過對(duì)第三條啟動(dòng)子-35元件(TTCTCA)的點(diǎn)突變分析發(fā)現(xiàn)，C和T兩個(gè)堿基對(duì)保持啟動(dòng)子的強(qiáng)度是非常重要的

3、，任何突變均可引起GFP表達(dá)量嚴(yán)重下降。 在cpcB基因上游序列中有6個(gè)短的開放閱讀框，其中三個(gè)可能具有編碼功能，推測(cè)這些開放閱讀框或其基因產(chǎn)物可能參與藻藍(lán)蛋白基因的表達(dá)調(diào)控。在-321-371的區(qū)域富含AT(90％)，它的缺失引起GFP表達(dá)水平下降，說(shuō)明該AT區(qū)域?qū)?dòng)子的活性有促進(jìn)作用。 采用SmartRace技術(shù)對(duì)藻藍(lán)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄特征進(jìn)行了分析。在藻體內(nèi)藻藍(lán)蛋白基因只有一條轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，從PCR產(chǎn)物的大小和對(duì)轉(zhuǎn)錄起始

4、位點(diǎn)的分析可知，基因的轉(zhuǎn)錄是由第一條啟動(dòng)子決定的。還克隆了節(jié)旋藻其他品系的cpcB基因的部分上游序列和編碼區(qū)的部分序列。所擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度分別為474bp，包括257bp的上游序列和217bp的編碼區(qū)序列。所克隆的上游序列，以及FACHB438，F(xiàn)ACHB793和FACHB790的cpcB基因編碼區(qū)序列未見報(bào)道。從比對(duì)結(jié)果看，供試的7個(gè)序列的堿基變異不大。在474bp中，共有31處變異，其中上游序列21處，編碼區(qū)10處，且變異主要集中在F

5、ACHB439，其他序列僅個(gè)別堿基的改變。cpcB基因的上游序列的相似性表明，不同品系的節(jié)旋藻的藻藍(lán)蛋白基因可能存在共同的表達(dá)調(diào)控機(jī)制。 通過同源重組的方法，將藻藍(lán)蛋白基因上游序列及其驅(qū)動(dòng)的gfp基因整合到聚球藻Synechococcussp.PCC7942的基因組中，通過熒光顯微鏡檢測(cè)和流式細(xì)胞儀證明，GFP能夠在其中表達(dá)，從而構(gòu)建了以異源藍(lán)藻為宿主的報(bào)告基因表達(dá)系統(tǒng)。并考察了光強(qiáng)對(duì)GFP表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)證明，光強(qiáng)對(duì)GFP表達(dá)

6、的有一定的影響。光強(qiáng)在10μmolm-2s-1時(shí)，GFP表達(dá)水平最高。當(dāng)?shù)陀?0μmolm-2s-1時(shí)，光強(qiáng)度越小，GFP表達(dá)水平越低。當(dāng)光強(qiáng)大于10μmolm-2s-1時(shí)，光強(qiáng)度越高，GFP表達(dá)水平反而越低。通過cpcB基因上游序列5'端缺失分析，在-218至-276的區(qū)域可能存在光反應(yīng)元件。 在該報(bào)告系統(tǒng)還考察了硫、磷、氮、鐵等元素缺乏對(duì)GFP表達(dá)的影響。在營(yíng)養(yǎng)元素缺乏的情況下，GFP的表達(dá)水平均有不同程度的下降。其中，硫元