大鼠GCLC基因上游調(diào)控序列相關(guān)元件的功能分析.pdf

1、氧化應(yīng)激與多種重大疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，嚴(yán)重威脅人類的身心健康。GSH是體內(nèi)重要的抗氧化劑和自由基清除劑，在維持正常的氧化還原狀態(tài)起著至關(guān)重要的作用。GCL是體內(nèi)合成GSH的限速酶，包括催化亞基(GCLC)和調(diào)節(jié)亞基(GCLM)，其中GCLC具有GCL所有的催化活性，是合成GSH的首要限速步驟。課題組前期對大鼠GCLC上游1759 bp調(diào)控序列研究發(fā)現(xiàn)近端存在2個相鄰的E-box元件(-804~-779，-729~-724)，均對GC

2、LC的轉(zhuǎn)錄起抑制作用。研究這兩個E-box元件的生理活性發(fā)現(xiàn)由于存在其他E-box元件會影響實驗結(jié)果，故構(gòu)建了GCLC上游876 bp的調(diào)控序列的熒光素酶報告載體，此片段中經(jīng)典E-box元件有三個，E-box1(-590~-585)為之前未討論的元件，故構(gòu)建GCLC上游不同長度(1759 bp、876 bp)調(diào)控序列的熒光素酶報告載體，定點缺失不同E-box1(-590~-585)、E-box2(-729~-724)、E-box3(-8

3、04~-779)，觀察E-box元件的可能作用方式以及生理功能。同時發(fā)現(xiàn)，GCLC蛋白發(fā)生入核表達(dá)的現(xiàn)象，對于其入核機(jī)制進(jìn)行了多方面的探索。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GCLC基因上游的TATA(-306~-301)啟動子元件為報道的經(jīng)典GCLC啟動子，可能存在其他啟動子元件對GCLC基因表達(dá)的進(jìn)行調(diào)控，進(jìn)而引起GCLC表達(dá)蛋白入核表達(dá)。
　　目的:
　　分析GCLC上游近端876 bp調(diào)控序列內(nèi)3個E-box元件在GCLC基因表達(dá)調(diào)控中的作

4、用及可能的生理功能；針對大鼠GCLC基因上游的TATA元件(-306~-301)，分析是否存在非TATA的啟動子元件起始GCLC基因轉(zhuǎn)錄，探討GCLC基因表達(dá)蛋白發(fā)生入核現(xiàn)象的機(jī)制。
　　方法:
　　1、熒光素酶報告載體的構(gòu)建為了解E-box元件在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的作用，需要利用熒光素酶報告基因?qū)η贸鼸-box元件的上游調(diào)控序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄活性檢測，并對該元件不同序列直接進(jìn)行分析。
　　(1)構(gòu)建含大鼠GCLC基因上游5892

5、bp調(diào)控序列的熒光素酶報告載體GCLC5892-luc和缺失了一段長約1500 bp的富含E-box片段的熒光素酶報告載體GCL C4347-luc。
　　(2)構(gòu)建含缺失E-box1(-590~-585)元件的大鼠GCLC基因上游1759 bp和876 bp調(diào)控序列的熒光素酶報告載體，研究E-box1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。
　　(3)構(gòu)建含不同缺失E-box元件的大鼠GCLC基因上游1759 bp和876 bp調(diào)控序列的熒光素酶

6、報告載體：分別以GCLC1759-luc、GCLC1759-del-E-box2-luc、G CLC1759-del-E-box3-luc、C1759-del-E-box2/3-luc為模板，設(shè)計引物，構(gòu)建GCLC1759-del-E-box1-luc、GCLC1759-del-E-box1/2-luc、GCLC1759-del-E-box1/3-luc、GC LC1759-del-E-box1/2/3-luc，組成GCLC1759-l

7、uc系列載體；GCLC876-luc、GCLC876-del-E-box1-luc、GCLC876-del-E-box2-luc、GCLC876-del-E-box3-luc、GCLC876-del-E-box1/2-luc、GCLC876-del-E-box1/3-luc、GCLC876-del-E-box2/3-luc、GCLC876-del-E-box1/2/3-luc，組成GCLC876-luc系列載體。
　　(4)構(gòu)建突

8、變 TATA(-306~-301)元件的GCLC1759-mu-TATA-luc、GCLC876-mu-TATA-luc報道載體。
　　(5)構(gòu)建突變疑似啟動子 INR1(-107~-101)、INR2(-616~-610)、INR3(-862~-856)元件的GCLC876-mu-INR1-luc、GCLC876-mu-INR2-luc、GCLC876-mu-TATA-mu-INR1-luc、GCLC876-mu-TATA-mu

9、-INR2-luc、GCLC1759-mu-INR3-luc、GCLC1759-mu-TATA-mu-INR3-luc報道載體。
　　2、調(diào)控序列在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄活性的測定將成功構(gòu)建的報道載體分別與PRL-SV40共轉(zhuǎn)染L2細(xì)胞，24小時后檢測熒光素酶活性，通過比較野生與突變報道載體的轉(zhuǎn)錄活性，以判斷E-box元件、TATA元件和疑似起始子INR元件對GCLC基因轉(zhuǎn)錄活性的影響。
　　3、 PCR方法檢測可能存在的不同剪接版本。

10、
　　4、免疫蛋白印跡(Western Blot)方法檢測細(xì)胞核內(nèi)GCLC蛋白表達(dá)的情況。
　　5、電泳遷移率分析(EMSA)分析TATA元件和INR元件是否能和核蛋白特異性結(jié)合。
　　結(jié)果:
　　1、經(jīng)測序鑒定，各種熒光素酶報道載體符合預(yù)期設(shè)計，成功構(gòu)建。
　　2、螢火蟲熒光素酶活性檢測結(jié)果：
　　(1) GCLC5892-luc、GCLC4347-luc轉(zhuǎn)染L2細(xì)胞后，缺失了一段富含E-box元件

11、能使熒光素酶活性顯著上調(diào)(P<0.05)。
　　(2)各缺失E-box元件的熒光素酶報告載體轉(zhuǎn)染L2細(xì)胞后，在大鼠上游1759 bp和876 bp調(diào)控序列中，無論是單缺失、雙缺失還是三缺失E-box元件與野生型載體相比較，都使熒光素酶活性顯著上調(diào)(P<0.05)，說明這3個E-box元件均起轉(zhuǎn)錄抑制作用。
　　(3) GCLC1759-mu-TATA-luc、GCLC876-mu-TATA-luc載體與野生型載體相比較，熒光

12、素酶活性顯著下降(P<0.01)，說明缺失了TATA元件會使GCLC基因表達(dá)減少；與pGL3-enhancer空白對照載體相比發(fā)現(xiàn)活性依然存在，這表明存在不同的起始位點指導(dǎo)后期翻譯表達(dá)結(jié)果。
　　(4)對疑似的啟動子INR進(jìn)行分析，GCLC876-mu-INR1-luc、GCLC876-mu-INR2-luc、GCLC876-mu-TATA-mu-INR1-luc、GCLC876-mu-TATA-mu-INR2-luc、GCL C

13、1759-mu-INR3-luc、GCLC1759-mu-TATA-mu-INR3-luc載體與野生型載體相比較，熒光素酶活性表達(dá)各異，選取其中能使熒光素酶活性降低的載體再進(jìn)行其他實驗驗證。
　　3、 DNA表達(dá)分析，推測可能的剪接版本進(jìn)而可能的INR位置。
　　4、免疫蛋白印跡(Western Blotting)檢測到細(xì)胞核內(nèi)GCLC蛋白表達(dá)很多，大小不一。
　　5、電泳遷移率變動分析(EMSA)結(jié)果顯示TATA元件

14、能與L2細(xì)胞核蛋白特異結(jié)合，而疑似的INR元件未發(fā)現(xiàn)可與L2細(xì)胞核蛋白特異結(jié)合。
　　結(jié)論:
　　1、大鼠GCLC基因上游調(diào)控序列中，眾多E-box元件被發(fā)現(xiàn)有一定的生理活性，即表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄抑制作用，并成功構(gòu)建空白實驗組GCLC876-del-E-box1/2/3-luc。
　　2、大鼠GCLC基因上游存在非TATA(-306~-301)的啟動子，可能導(dǎo)致不同的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，導(dǎo)入NLS序列，進(jìn)而導(dǎo)致GCLC基因表達(dá)蛋白的入核