AHR-ARNT元件抑制GCLC基因在大鼠支氣管上皮細(xì)胞的表達(dá).pdf

1、谷胱甘肽（GSH）是體內(nèi)重要的抗氧化、抗炎物質(zhì)，對(duì)保護(hù)組織器官免受氧化損傷具有重要作用。γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）是合成GSH的限速酶，其催化亞單位GCLC具有全酶的催化活性。對(duì)于該酶基因表達(dá)調(diào)節(jié)的了解能夠有助于在分子水平闡明GSH變化的機(jī)制。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，GCLC基因上游調(diào)控序列存在一個(gè)轉(zhuǎn)錄抑制區(qū)域，其中兩個(gè)E-box元件（-804～-799，-729～-724）在大鼠多種組織來(lái)源的細(xì)胞中起負(fù)性調(diào)控作用，并且具有組織

2、特異性。文獻(xiàn)報(bào)道和我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果均提示E-box元件具有雙向調(diào)控的性質(zhì)，這一特點(diǎn)與旁側(cè)元件的組成以及結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子有關(guān)。為此分析了大鼠GCLC基因上游調(diào)控序列中與E-box元件相鄰的元件，其中AHR/ARNT元件引起我們的關(guān)注。該基因上游存在兩個(gè)核心序列同為CACGGG的AHR/ARNT元件，其中一個(gè)（-1090～-1085）位于E-box元件附近。其結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子芳香烴受體核轉(zhuǎn)位蛋白（ARNT）是許多bHLH-PAS蛋白共同的專(zhuān)性二聚

3、化配偶體，其中包括芳香烴受體（AHR）、低氧誘導(dǎo)因子（HIF）1α和2α、SIM蛋白等，參與機(jī)體內(nèi)許多重要的生物學(xué)過(guò)程。由于有報(bào)道指出轉(zhuǎn)錄因子ARNT能夠與E-box元件的結(jié)合蛋白USF1/2形成異源二聚體，使得E-box元件與ARNT之間相互作用的假設(shè)在理論上具有可信性，并且由于其結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子與低氧、毒物代謝等生命活動(dòng)相關(guān)，故如果該關(guān)系存在，就可能解釋眾多關(guān)于細(xì)胞應(yīng)激以及氧化-抗氧化平衡等問(wèn)題。為此本研究首先對(duì)這兩個(gè)AHR/ARNT

4、元件在大鼠的GCLC基因轉(zhuǎn)錄中是否具有調(diào)控作用進(jìn)行了系統(tǒng)分析。 目的:探討位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-1090～-1085與-215～-210bp處的兩個(gè)AHR/ARNT元件對(duì)RTE細(xì)胞內(nèi)的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）催化亞單位（GCLC）是否具有轉(zhuǎn)錄抑制作用，從而了解γ-GCS基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)特征。 方法: 1、報(bào)道載體以及真核表達(dá)載體的構(gòu)建：（1）缺失AHR/ARNT元件報(bào)道載體：?jiǎn)稳笔HR/ARNT元件報(bào)

5、道載體的構(gòu)建是以GCLC-luc（-1758～+2）為模板，按照引物導(dǎo)入核心序列缺失的方法，通過(guò)兩次PCR擴(kuò)增出缺失-1090～-1085或-215～-210的AHR/ARNT元件的片段。兩種PCR產(chǎn)物膠回收后連入pGEM-T easy載體，以SacⅠ/XhoⅠ雙酶切插入pGL3-enhancer載體鑒定并測(cè)序。雙元件缺失載體GCLC-DdelAHR/ARNT-Luc的構(gòu)建是以GCLC-delAHR/ARNT（-1090）-Luc為模板

6、進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增，其余步驟與上述相同。（2）AHR/ARNT元件核心與相鄰序列報(bào)道載體：合成含有核心序列并包括相鄰序列的AHR/ARNT（-1090）和AHR/ARNT（-215）正義和其反向互補(bǔ)鏈，預(yù)留SacⅠ/XhoⅠ酶切位點(diǎn)，采用逐漸退火的方法使兩條單鏈互補(bǔ)配對(duì)，然后利用這兩個(gè)位點(diǎn)按常規(guī)分子克隆技術(shù)將片段克隆入pGL3-promoter載體。（3）真核表達(dá)質(zhì)粒：按Invitrogen公司的Trizol試劑提供的方法提取大鼠肝臟總

7、RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑合成大鼠肝臟cDNA，PCR擴(kuò)增出AHR、AHRR、ARNT2、ARNT片段。產(chǎn)物行1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定并切膠回收后連入pGEM-T easy載體，HindⅢ/NotⅠ雙酶切鑒定并測(cè)序。測(cè)序正確目的基因片段按照常規(guī)克隆技術(shù)連入pRc/CMV2載體并測(cè)序證實(shí)。 2、調(diào)控序列的細(xì)胞內(nèi)促轉(zhuǎn)錄活性的測(cè)定：將GCLC-Luc、單缺失AHR/ARNT元件的GCLC-Luc、雙缺失AHR/ARNT元件的GCLC-L

8、uc、PGL3-Promoter以及含有AHR/ARNT元件核心與旁側(cè)序列的報(bào)告基因載體轉(zhuǎn)染大鼠RTE細(xì)胞，檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的螢光素酶活性值，來(lái)判斷AHR/ARNT元件對(duì)GCLC基因轉(zhuǎn)錄活性的影響。 3、與AHR/ARNT元件可能結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子過(guò)量表達(dá)實(shí)驗(yàn)：將GCLC-Luc、缺失AHR/ARNT元件和雙缺失AHR/ARNT元件的報(bào)告基因載體分別與四種真核表達(dá)質(zhì)粒AHR-CMV2、AHRR-CMV2、ARNT-CMV2、ARNT2

9、-CMV2共轉(zhuǎn)染大鼠RTE細(xì)胞，通過(guò)增強(qiáng)AHR/ARNT元件與可能和該元件結(jié)合的反式作用因子的作用，觀察其對(duì)GCLC基因轉(zhuǎn)錄活性的影響。 4、電泳遷移率變動(dòng)分析實(shí)驗(yàn)（EMSA）以及Supershift：觀察在RTE細(xì)胞中AHR/ARNT元件是否有核蛋白特異性結(jié)合，并用Supershift檢測(cè)其結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子是否是前期實(shí)驗(yàn)所推測(cè)的轉(zhuǎn)錄因子AHR以及ARNT。 結(jié)果: 1、成功構(gòu)建含GCLC上游啟動(dòng)子序列分別單缺失A

10、HR/ARNT元件（-1090～-1085以及-215～-210）的報(bào)告基因載體（GCLC-delAHR/ARNT（-1090）-luc、GCLC-delAHR/ARNT（-215）-luc），雙缺失AHR/ARNT元件的報(bào)告基因載體（GCLC-DdelAHR/ARNT-Luc），含有AHR/ARNT元件核心與旁側(cè)序列的報(bào)告基因載體（AHR/ARNT（-1090）-Promoter以及AHR/ARNT（-215）-Promoter）以及

11、真核表達(dá)載體AHR-CMV2、AHRR-CMV2、ARNT-CMV2、ARNT2-CMV2。 2、實(shí)驗(yàn)中將GCLC-Luc及其定點(diǎn)缺失AHR/ARNT元件的GCLC-Luc以及PGL3-Promoter、AHR/ARNT（-1090）-Promoter和AHR/ARNT（-215）-Promoter轉(zhuǎn)染大鼠支氣管上皮細(xì)胞（RTE），結(jié)果表明缺失AHR/ARNT元件（-1090～-1085）的GCLC基因5’-上游序列的轉(zhuǎn)錄活性明

12、顯高于野生型基因5’-上游序列，GCLC-delAHR/ARNT（-1090）-luc在細(xì)胞內(nèi)螢光素酶活性水平是GCLC-Luc的2.16倍；而缺失兩個(gè)AHR/ARNT元件的效果與缺失上述元件相同，GCLC-DdelAHR/ARNT-luc螢光素酶活性水平是GCLC-Luc的2.21倍，兩者均差異顯著；轉(zhuǎn)染AHR/ARNT（-1090）-Promoter的螢光素酶值明顯高于轉(zhuǎn)染PGL3-Promoter的螢光素酶值，是PGL3-Prom

13、oter的2.61倍。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明AHR/ARNT元件（-1090～-1085）在RTE細(xì)胞中具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性，而在GCLC基因的基礎(chǔ)狀態(tài)下的轉(zhuǎn)錄表達(dá)中起抑制作用。 3、將AHR-CMV2和GCLC-Luc以及單缺失或雙缺失AHR/ARNT元件的GCLC-Luc共轉(zhuǎn)染RTE細(xì)胞的螢光素酶值與CMV2空載體和GCLC-Luc以及單缺失或雙缺失AHR/ARNT元件的GCLC-Luc共轉(zhuǎn)染RTE細(xì)胞的螢光素酶值進(jìn)行比較。結(jié)果提示GCL

14、C-Iuc和CMV2空載體共轉(zhuǎn)染的螢光素酶值是GCLC-luc和AHR-CMV2共轉(zhuǎn)染的螢光素酶值的2.37倍。這說(shuō)明轉(zhuǎn)錄因子AHR的過(guò)表達(dá)對(duì)GCLC基因具有負(fù)性調(diào)控作用，而其它轉(zhuǎn)錄因子AHRR、ARNT以及ARNT2的過(guò)表達(dá)對(duì)GCLC基因不具有明顯調(diào)控作用。 4、電泳遷移率變動(dòng)分析（EMSA）以及Supershift結(jié)果顯示GCLC基因上游調(diào)控區(qū)域的兩個(gè)AHR/ARNT元件均有核蛋白結(jié)合，并且超級(jí)遷移率變動(dòng)實(shí)驗(yàn)顯示結(jié)合的蛋白主