人小涎腺上皮干-祖細(xì)胞成肝誘導(dǎo)的相關(guān)研究.pdf

1、目的:
　　1.體外對人小涎腺上皮干/祖細(xì)胞(hMSG-EpiPCs)進(jìn)行成肝誘導(dǎo)，鑒定誘導(dǎo)獲得細(xì)胞的表型和檢測其是否具有成熟肝臟細(xì)胞相關(guān)功能。
　　2.移植hMSG-EpiPCs給急性肝損傷模型小鼠，鑒定其對小鼠急性肝功能損傷的修復(fù)能力，評估移植細(xì)胞成活率及肝內(nèi)轉(zhuǎn)歸。
　　方法:
　　1.利用組織塊貼壁法從人小涎腺組織中分離培養(yǎng)出上皮干/祖細(xì)胞，體外傳代擴(kuò)增培養(yǎng)。利用免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)鑒定其干細(xì)胞表型和特異性

2、標(biāo)記物。體外Matrigel構(gòu)建三維培養(yǎng)環(huán)境下對hMSG-EpiPCs進(jìn)行成肝誘導(dǎo)并設(shè)立空白對照組。利用免疫熒光及Real-time PCR檢測誘導(dǎo)而來的細(xì)胞相關(guān)肝臟細(xì)胞表型表達(dá)，并通過PAS染色、ICG攝取和CYP450功能測定檢測其相關(guān)成熟肝臟細(xì)胞功能。
　　2.使用CM-Dil熒光標(biāo)記hMSG-EpiPCs并觀察標(biāo)記后細(xì)胞生長情況。建立聯(lián)合免疫缺陷(SCID/Beige)小鼠20％CCl4腹腔注射急性肝損傷模型，隨機(jī)分為兩組

3、:實驗組移植hMSG-EpiPCs(n=12)，對照組注射PBS(n=12)，另取正常SCID小鼠作為空白對照組(n=3)。術(shù)后觀察小鼠體重變化。并于移植后1天、3天、1周及2周分別取材。檢測小鼠血清中人血清白蛋白含量和肝功。對取材肝臟組織進(jìn)行HE染色和肝細(xì)胞表型免疫熒光鑒定，觀察炎癥反應(yīng)和注射細(xì)胞存活及轉(zhuǎn)歸情況。
　　結(jié)果:
　　1.成功分離培養(yǎng)獲得人小涎腺上皮干/祖細(xì)胞。該細(xì)胞生長良好，呈鋪路石狀。免疫熒光及細(xì)胞流式分析

4、表明，獲得的hMSG-EpiPCs表達(dá)CD29、CD49f、ABCG2、PLET-1及細(xì)胞角蛋白等上皮干/祖細(xì)胞標(biāo)記、涎腺上皮細(xì)胞標(biāo)記CD44及CD166、人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)、胸腺上皮祖細(xì)胞標(biāo)記物K5和K8、內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物CD31、基底膜黏蛋白(LAMININ)及Wnt信號通路標(biāo)記LGR5和LGR6，部分表達(dá)胚胎干細(xì)胞標(biāo)記SOX2。hMSG-Epi

5、PCs在體外三維培養(yǎng)環(huán)境下可誘導(dǎo)向肝細(xì)胞樣細(xì)胞分化。誘導(dǎo)而來細(xì)胞表達(dá)肝細(xì)胞標(biāo)記蛋白ALB、CK18、CYP3A4和AAT，不表達(dá)AFP。ICG攝取和PAS染色均為陽性。CYP3A4和CYP2C19功能檢測陽性。
　　2.CM-Dil紅色熒光標(biāo)記hMSG-EpiPCs生長狀況好。實驗組小鼠體重恢復(fù)速度比對照組快，肝重-體重比值更低，ALT、AST及TBIL下降速度與下降程度顯著優(yōu)于對照組。兩周后實驗組小鼠血清中可檢測到HSA。肝臟病

6、理切片顯示，實驗組小鼠一周后肝臟病變已基本恢復(fù)正常，而對照組小鼠一周后肝臟仍有病變肝細(xì)胞。肝臟組織切片顯示，兩周后實驗組有紅色熒光標(biāo)記hMSG-EpiPCs存活，表達(dá)肝細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記AFP、ALB和CK18。
　　結(jié)論:
　　1.hMSG-EpiPCs可在體外成肝誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞，表達(dá)相關(guān)表型，并具有一定的肝細(xì)胞功能。
　　2.移植hMSG-EpiPCs可促進(jìn)急性肝損傷模型小鼠的肝臟功能恢復(fù)，移植細(xì)胞存活并參與病變