骨髓造血干祖細胞微環(huán)境的形成.pdf

1、目的：造血干細胞(Hematopoietic stem cells，HSC)是最早被研究和利用的成體干細胞之一。由于體內(nèi)HSC的命運取決于其與其所在的骨髓HSC微環(huán)境(niche)間復雜而動態(tài)的分子信號交流，因此，進一步解析機體造血調(diào)控的機制，以及如何在體外大量擴增HSC，同時維持其自我更新和多向分化的潛能，至今仍是血液學研究領域中的重要問題。1978年，Ray Schofield首次揭示了骨髓niche對于 HSC的重要調(diào)控作用。此后

2、，逐步發(fā)展的實驗技術和實驗手段使人們能夠去研究niche結構生物學，不同niche組分的特定功能，以及其在血液疾病發(fā)生發(fā)展過程中的作用。目前研究發(fā)現(xiàn)，骨髓niche主要有骨內(nèi)膜niche和血管周niche兩大類，但是對于構成骨髓niche的細胞組分來源知之甚少。本課題旨在探究構成骨髓niche細胞的來源，以及細胞自噬在其中的作用。具體目標:(1)明確骨髓移植前致死劑量輻照對骨髓niche的破壞作用;(2)探究供體造血干祖細胞是否參與移植

3、后受體骨髓niche的重建;(3)探究造血干祖細胞的正常自噬功能對骨髓niche形成的影響。
　　方法：(1)給予野生型小鼠9 Gy致死劑量60Co伽馬射線全身輻照，采用流式檢測小鼠骨髓中造血細胞以及非造血的骨髓微環(huán)境細胞的比例以及數(shù)量變化情況，并通過CCK-8檢測輻照對骨髓單個核細胞的生存活力的影響。(2)采用具有自噬基因標記的Atg7f/f;GFP-LC3小鼠作為供體，分選骨髓LSK造血干祖細胞移植至WT小鼠體內(nèi)，同時設置反向

4、移植對照實驗。造血重建后流式檢測是否存在骨髓niche的重建，并流式檢測GFP陽性細胞比例以及基因型鑒定檢測骨髓niche重建的細胞來源。(3)采用Micro-CT掃描、流式細胞術、骨髓切片HE染色、免疫組化、實時熒光定量RT-PCR技術檢測造血干祖細胞功能異常(Atg7f/f;Vav-Cre小鼠)對骨髓niche結構、細胞組分、功能的影響。(4)采用競爭性移植實驗檢測造血干祖細胞功能異常對骨髓niche形成的影響;并將野生型小鼠骨髓移

5、植到Atg77/7;Vav-Cre小鼠體內(nèi)進行挽救實驗，通過流式細胞術、集落形成實驗檢測造血干祖細胞重建骨髓niche的能力。
　　結果：(1)9Gy致死劑量輻照不僅能夠清除骨髓中的有核造血細胞，也能夠?qū)撬鑞iche包括基質(zhì)細胞、CAR細胞、內(nèi)皮細胞在內(nèi)的骨髓niche細胞產(chǎn)生顯著的殺傷作用。（2)骨髓移植造血重建的過程中同樣存在非造血的骨髓niche的重建，并且重建的細胞可以來源于供體的LSK造血干祖細胞細胞。（3)造血干祖細